发酵对蛋白桑1-脱氧野尻霉素提取量的影响

李 旺，韩蕴琦，丁 轲，曹平华，赵龙妹

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023）

蛋白桑属于桑树属，是由全国各地收集的28个桑树品种经过长期选择与改良，杂交优化而得的新品系 （熊意等，2016）。桑树中有多种生物碱成分，其中1-脱氧野尻霉素（DNJ）作为一种多羟基生物碱，是降血糖的主要活性成分，具有明显的降血糖作用 （戴开金等，2009；张旻等，2008）。DNJ能够抑制α-糖苷酶的活性，通过降低小肠对糖类物质的分解吸收和促进胰岛素分泌，从而达到降低血糖的作用，是一种治疗糖尿病的有效药物（Zhang 等，2014；沈小月等，2014；胡竞一等，2006）。此外，还具有抗病毒（彭忠田等，2007）、抑制肿瘤转移 （Lim等，2013）、降血压 （Yang等，2012）、降血脂（Kim 等，2011）等功效，具有很高的食用和药用价值。

目前，桑叶中DNJ含量的测定多采用高效液相色谱法，本试验采用高效液相色谱荧光检测法进行检测，该方法具有操作简单、灵敏度好、准确度高、衍生化反应速度快、反应产物稳定等优点（欧阳臻等，2005）。DNJ的提取量受多种因素影响，本试验旨在通过探讨不同发酵方式和提取方法对DNJ提取量的影响，为提高DNJ的提取量和蛋白桑资源的利用率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 蛋白桑采自河南汝州市河南宏翔生物科技有限公司蛋白桑种植基地。菌种：产朊假丝酵母（Candida.utilis，CICC 32211）、枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis，LN）均为河南科技大学宏翔生物饲料实验室保存，使用前活化。DNJ标准品（Sigma公司），FMOC-Cl（上海谱振生物科技有限公司），乙腈（默克公司），其他试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。高效液相色谱仪荧光检测器（美国waters公司），台式冷冻高速离心机 （美国Thermo Fisher公司），电热恒温水浴箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 发酵液制备 酵母菌活化：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个酿酒酵母的单菌落，置于装有5 mL液体培养基的试管中，30℃、200 r/min振荡培养12 h，按照2%的体积比接种到装液量20%的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12 h左右，至活菌数1×109cfu/mL，收集发酵液备用。

枯草芽孢杆菌活化：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个枯草芽孢杆菌的单菌落，置于装有5 mL液体培养基的试管中，37℃、200 r/min振荡培养12 h，按照2%的比例接种到装液量20%的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12 h，至活菌数5×109cfu/mL，收集发酵液备用。

1.2.2 发酵样品制备 以酵母和枯草芽孢杆菌为发酵菌种，体积比1：1。准确称取50.00 g自然晒干蛋白桑粉9份，分别放置于500 mL锥形瓶中，按照料液比1：1，加蒸馏水，搅拌均匀，在121℃灭菌20 min，冷却至室温后，按照表1设计正交试验接种，在不同条件下进行发酵，发酵结束后，在烘箱中60℃烘干，测定枯草芽孢杆菌活菌数（每个样品测定3次），作为发酵效果评价标准，用于筛选最佳发酵方案。按照最佳发酵方案发酵苜蓿作为DNJ提取试验的阴性对照，验证DNJ与发酵菌种是否相关。

1.2.3 DNJ的提取 按照1.2.2方法制备的样品均采用盐酸提取法、水提取法和乙醇提取法三种方法进行提取。

盐酸提取法：准确称取0.2 g蛋白桑粉放置于5 mL离心管，加入0.05 mol/L盐酸溶液3 mL，涡旋提取 30 s，10000 r/min高速离心 15 min，取上清液，残渣再加入0.05 mol/L盐酸溶液重复提取一次，合并两次提取液，加蒸馏水定容至50 mL，备用。

水提取法：准确称取0.5 g蛋白桑粉放置于50 mL离心管，加入适量超纯水，80℃水浴浸提2次，每次2 h，高速离心后取上清液，合并两次提取液，加超纯水定容至100 mL，备用。

乙醇提取法：准确称取0.5 g蛋白桑粉放置于圆底烧瓶，加入一定量的70%乙醇，加热回流提取2次，每次2 h，合并两次滤液定容至100 mL，备用。

1.2.4 DNJ含量测定 参考欧阳臻（2004）的方法进行测定。DNJ的衍生化：取提取液10μL置于1.5 mL离心管，加入10μL硼酸盐缓冲液（pH=8.5）混合，在加入5 mmol/L的FMOC-Cl乙腈混合液20 μL，均匀混合后于20℃水浴条件下反应20 min，然后加入0.1 mol/L甘氨酸10μL与剩余的衍生化试剂反应，终止反应。最后，加入0.1%的醋酸水溶液950μL稀释，混合均匀后用0.45μm一次性无菌针头过滤器过滤，取10μL进行进样分析。

高效液相色谱条件：色谱柱：C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：0.1%醋酸-乙腈（45：55，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；荧光检测器激发波长254 nm，发射波长322 nm，进样量10μL。

绘制标准曲线：准确称取3.4 mg的DNJ标准品定容于100 mL蒸馏水中，制得标准品母液，吸取不同体积的标准品母液配制成不同浓度的DNJ标准溶液。吸取不同浓度的标准液进行衍生化和液相色谱分析，结果以标准品溶液浓度（X）为横坐标，色谱峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。

1.3 数据统计与分析 每个样品重复测定3次，所得试验数据用Excel 2007进行记录和收集，用SPSS 22进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 桑叶发酵样品的筛选 由表1可知，通过正交试验设计各个发酵方案，不同的发酵条件对样品活菌数的影响比较明显。通过计算极差分析表明，各试验因素对发酵桑叶总菌数的影响顺序为：温度＞接种量＞时间，温度对发酵的影响最大，其次是接种量，而时间在48～96 h内，对发酵效果影响最小。进一步对试验结果进行主效应分析表明，由于因素交互作用的干扰，温度、接种量和发酵时间因素之间的差异均不显著 （P＞0.05）（表2）。通过多重比较进行各因素组内的差异分析，不同接种量和发酵时间组内差异不显著（P＞0.05），不同发酵温度组内35℃的结果显著高于30℃和40℃（P＜0.05），说明温度是影响发酵效果的主要因素，接种量和发酵时间影响较小。

表1 发酵方案正交试验设计及结果

表2 活菌总数主效应检验

故本试验后续样品根据正交试验结果，以6%的接种量在35℃分别培养48、72、96 h时取样，分别命名样品1、样品2和样品3，进行野尻霉素提取和测定试验。

2.2 发酵对盐酸提取法DNJ提取量的影响 由表3可知，盐酸提取法在不同发酵条件下DNJ提取量由高到低为：发酵样品3＞发酵样品2＞发酵样品1＞空白对照＞阴性对照。发酵样品3的DNJ提取量最高，为（1.44±0.03）mg/g，比空白对照组高13.39%，显著高于其他样品的DNJ提取量 （P＜0.05）。 对照组的 DNJ提取量最低，为（1.27±0.06）mg/g，显著低于各组发酵样品DNJ提取量 （P＜0.05）。发酵样品1和发酵样品2的DNJ提取量差异不显著（P＞ 0.05）。

2.3 发酵对水提取法DNJ提取量的影响 由表3可知，水提取法在不同发酵条件下DNJ提取量由高到低为：发酵样品3＞发酵样品2＞发酵样品1＞空白对照＞阴性对照。发酵样品3的DNJ提取量最高，为（1.35±0.06）mg/g，比对照组高 51.69%，显著高于其他样品的DNJ提取量（P＜0.05）。对照组的 DNJ提取量最低，为（0.89±0.07）mg/g，显著低于发酵样品DNJ提取量（P＜0.05）。而且，不同条件下的DNJ提取量均有显著差异（P＜0.05）。

2.4 发酵对乙醇提取法DNJ提取量的影响 由表3可知，乙醇提取法在不同发酵条件下DNJ提取量由高到低为：发酵样品3＞发酵样品2＞发酵样品1＞空白对照＞阴性对照。发酵样品3的DNJ提取量最高，为（1.58±0.03）mg/g，提取量比对照组高17.03%，显著高于其他样品的DNJ提取量（P＜0.05）。对照组的DNJ提取量最低，为（1.35±0.07）mg/g， 与发酵样品 1 的 DNJ提取量差异不显著 （P＞0.05）。2.2～2.4结果说明，DNJ的提取量跟发酵时间的长短有很大关系，发酵时间长，微生物和酶作用的时间长，能够使DNJ更多的溶出，有利于提取，三种提取方法均是样品3（发酵时间长）的样品提取量最高。阴性对照采用相同发酵菌种和温度，发酵96 h，但结果并无明显的DNJ含量。说明，DNJ来源于蛋白桑，而与发酵菌种无直接关系。

2.5 提取方法对发酵样品DNJ提取量的影响由表3可知，对4个样品的提取均是醇提法效果最佳。对未经发酵处理的桑叶样品（对照）和发酵样品1乙醇提取法的提取效果最好，盐酸提取法的提取效果次之，水提取法的提取效果最差。醇提法和酸提法提取的DNJ含量显著高于水提法，但醇提取法和酸提取法的DNJ提取量差异不显著（P＞0.05）。发酵样品2和发酵样品3用三种提取方法的DNJ提取量均差异显著（P＜0.05）。醇提法最好，水提法最差。说明，醇作为有机溶剂更适合做小分子有机物DNJ的提取剂。

表3 提取方法对不同发酵样品DNJ提取量的影响mg/g

2.6 方法学考察结果

2.6.1 标准曲线线性 按照1.2.4的方法和色谱条件得到DNJ标准品色谱图和样品的DNJ色谱图，结果见图1。表明各成分分离良好。以标准品溶液浓度（X）为横坐标，色谱峰面积（Y）为纵坐标作图，得到回归方程Y=2584067X+743351，R2=0.9993，表明在0.34～17μg/mL具有良好的线性关系，结果见图2。

2.6.2 回收率和精密度 对发酵前蛋白桑中的DNJ进行加标处理，回收率试验结果如表4所示。由表4可知，样品平均回收率为98.6%，RSD为1.87%，说明回收率和精密度良好。

3 讨论与结论

表4 桑叶的加样回收率试验结果（n=9）

3.1 DNJ的提取方法 DNJ提取的方法很多，常用的有水提取法、盐酸提取法、乙醇提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等。曾锐等（2009）用水煎煮提取不同品种桑的不同部位，在不同桑粉中的DNJ含量差异较大，验证了方法的可靠性。刘凡等（2012）用0.05 mol/L的盐酸溶液对不同桑树品种桑叶DNJ进行提取，获得了较高的提取量。刘伟鋆等（2009）用70%的乙醇提取桑叶中的DNJ，提取液经过纯化后，得到DNJ含量为23.2%。胡瑞君等（2007）在提取桑叶中的DNJ时，以微波处理作为辅助条件，优化了微波处理工艺，提高了提取量。郑晓静等（2012）在提取桑叶中的DNJ时，以超声波处理作为辅助条件，优化了超声波提取条件，提高了DNJ的提取量。说明不同的提取方法均具有一定的可行性，但结果存在差异，若通过不同的预处理方式，则可以对DNJ提取产生影响。本试验分别选用了水提取法、盐酸提取法和乙醇提取法三种方法提取蛋白桑样品中的DNJ，并对相同样品中DNJ的提取量进行了比较，结果发现盐酸提取法和乙醇提取法的DNJ提取量明显高于水提取法，这是因为DNJ是一种分子量很小的生物碱类化合物，易溶于酸性溶液，而乙醇对植物细胞有较强的穿透力，这都有利于对DNJ的提取。

3.2 发酵对DNJ含量的影响 DNJ的提取量除了受提取方法影响外，预处理方式对其影响也较大。发酵作为一种对桑叶的处理方式也能够影响桑叶中DNJ的提取量。肖洪等（2013a、2013b）用混合霉菌对桑叶进行发酵，探讨了不同菌种比例及不同发酵条件（发酵时间和发酵温度）对发酵桑叶茶中的多糖、多酚和DNJ含量的影响，结果发现不同的菌种比例和不同的发酵条件下桑叶茶中的DNJ含量均存在差异。杨清等（2010）探讨不同发酵条件对桑红茶中生物活性成分含量的影响发现，随着发酵时间延长，游离氨基酸和DNJ含量逐渐增加。孙国霞等（2011）研究了黑曲霉在不同发酵温度对桑红茶中生物活性成分含量的影响，结果发现不同的发酵温度下桑红茶中的DNJ含量有所差异，最佳发酵温度为32℃。最优的发酵方案有利于主要发酵菌种的增殖和代谢，菌数的增加和代谢产物的分解作用是桑叶活性成分溶出的主要原因。现有的发酵方案，多是人的保健品上的数据和经验，发酵菌种也多是真菌中的霉菌 （孙国霞等，2011；杨清等，2010）。本试验以酵母菌和芽孢杆菌的混合菌液对蛋白桑进行发酵，延长发酵时间有利于发酵菌种增殖和代谢，破坏了桑叶的细胞壁，增加了发酵桑叶中的酸、酚、醇、酯等小分子物质含量（邹凡华和刘松青，2018；陆春霞等，2018），使 DNJ更容易溶出，通过发酵DNJ的提取量均得到了提高，丰富了蛋白桑的发酵参数和发酵菌种选择。