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发酵对蛋白桑1-脱氧野尻霉素提取量的影响

2020-08-04韩蕴琦曹平华赵龙妹

中国饲料 2020年13期
关键词:菌种桑叶盐酸

李 旺,韩蕴琦,丁 轲,曹平华,赵龙妹

(河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023)

蛋白桑属于桑树属,是由全国各地收集的28个桑树品种经过长期选择与改良,杂交优化而得的新品系 (熊意等,2016)。桑树中有多种生物碱成分,其中1-脱氧野尻霉素(DNJ)作为一种多羟基生物碱,是降血糖的主要活性成分,具有明显的降血糖作用 (戴开金等,2009;张旻等,2008)。DNJ能够抑制α-糖苷酶的活性,通过降低小肠对糖类物质的分解吸收和促进胰岛素分泌,从而达到降低血糖的作用,是一种治疗糖尿病的有效药物(Zhang 等,2014;沈小月等,2014;胡竞一等,2006)。此外,还具有抗病毒(彭忠田等,2007)、抑制肿瘤转移 (Lim等,2013)、降血压 (Yang等,2012)、降血脂(Kim 等,2011)等功效,具有很高的食用和药用价值。

目前,桑叶中DNJ含量的测定多采用高效液相色谱法,本试验采用高效液相色谱荧光检测法进行检测,该方法具有操作简单、灵敏度好、准确度高、衍生化反应速度快、反应产物稳定等优点(欧阳臻等,2005)。DNJ的提取量受多种因素影响,本试验旨在通过探讨不同发酵方式和提取方法对DNJ提取量的影响,为提高DNJ的提取量和蛋白桑资源的利用率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 蛋白桑采自河南汝州市河南宏翔生物科技有限公司蛋白桑种植基地。菌种:产朊假丝酵母(Candida.utilis,CICC 32211)、枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis,LN)均为河南科技大学宏翔生物饲料实验室保存,使用前活化。DNJ标准品(Sigma公司),FMOC-Cl(上海谱振生物科技有限公司),乙腈(默克公司),其他试剂均为分析纯,实验用水为蒸馏水。高效液相色谱仪荧光检测器(美国waters公司),台式冷冻高速离心机 (美国Thermo Fisher公司),电热恒温水浴箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 发酵液制备 酵母菌活化:用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个酿酒酵母的单菌落,置于装有5 mL液体培养基的试管中,30℃、200 r/min振荡培养12 h,按照2%的体积比接种到装液量20%的三角瓶液体培养基中,继续摇床培养12 h左右,至活菌数1×109cfu/mL,收集发酵液备用。

枯草芽孢杆菌活化:用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个枯草芽孢杆菌的单菌落,置于装有5 mL液体培养基的试管中,37℃、200 r/min振荡培养12 h,按照2%的比例接种到装液量20%的三角瓶液体培养基中,继续摇床培养12 h,至活菌数5×109cfu/mL,收集发酵液备用。

1.2.2 发酵样品制备 以酵母和枯草芽孢杆菌为发酵菌种,体积比1:1。准确称取50.00 g自然晒干蛋白桑粉9份,分别放置于500 mL锥形瓶中,按照料液比1:1,加蒸馏水,搅拌均匀,在121℃灭菌20 min,冷却至室温后,按照表1设计正交试验接种,在不同条件下进行发酵,发酵结束后,在烘箱中60℃烘干,测定枯草芽孢杆菌活菌数(每个样品测定3次),作为发酵效果评价标准,用于筛选最佳发酵方案。按照最佳发酵方案发酵苜蓿作为DNJ提取试验的阴性对照,验证DNJ与发酵菌种是否相关。

1.2.3 DNJ的提取 按照1.2.2方法制备的样品均采用盐酸提取法、水提取法和乙醇提取法三种方法进行提取。

盐酸提取法:准确称取0.2 g蛋白桑粉放置于5 mL离心管,加入0.05 mol/L盐酸溶液3 mL,涡旋提取 30 s,10000 r/min高速离心 15 min,取上清液,残渣再加入0.05 mol/L盐酸溶液重复提取一次,合并两次提取液,加蒸馏水定容至50 mL,备用。

水提取法:准确称取0.5 g蛋白桑粉放置于50 mL离心管,加入适量超纯水,80℃水浴浸提2次,每次2 h,高速离心后取上清液,合并两次提取液,加超纯水定容至100 mL,备用。

乙醇提取法:准确称取0.5 g蛋白桑粉放置于圆底烧瓶,加入一定量的70%乙醇,加热回流提取2次,每次2 h,合并两次滤液定容至100 mL,备用。

1.2.4 DNJ含量测定 参考欧阳臻(2004)的方法进行测定。DNJ的衍生化:取提取液10μL置于1.5 mL离心管,加入10μL硼酸盐缓冲液(pH=8.5)混合,在加入5 mmol/L的FMOC-Cl乙腈混合液20 μL,均匀混合后于20℃水浴条件下反应20 min,然后加入0.1 mol/L甘氨酸10μL与剩余的衍生化试剂反应,终止反应。最后,加入0.1%的醋酸水溶液950μL稀释,混合均匀后用0.45μm一次性无菌针头过滤器过滤,取10μL进行进样分析。

高效液相色谱条件:色谱柱:C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:0.1%醋酸-乙腈(45:55,V/V);流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;荧光检测器激发波长254 nm,发射波长322 nm,进样量10μL。

绘制标准曲线:准确称取3.4 mg的DNJ标准品定容于100 mL蒸馏水中,制得标准品母液,吸取不同体积的标准品母液配制成不同浓度的DNJ标准溶液。吸取不同浓度的标准液进行衍生化和液相色谱分析,结果以标准品溶液浓度(X)为横坐标,色谱峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。

1.3 数据统计与分析 每个样品重复测定3次,所得试验数据用Excel 2007进行记录和收集,用SPSS 22进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 桑叶发酵样品的筛选 由表1可知,通过正交试验设计各个发酵方案,不同的发酵条件对样品活菌数的影响比较明显。通过计算极差分析表明,各试验因素对发酵桑叶总菌数的影响顺序为:温度>接种量>时间,温度对发酵的影响最大,其次是接种量,而时间在48~96 h内,对发酵效果影响最小。进一步对试验结果进行主效应分析表明,由于因素交互作用的干扰,温度、接种量和发酵时间因素之间的差异均不显著 (P>0.05)(表2)。通过多重比较进行各因素组内的差异分析,不同接种量和发酵时间组内差异不显著(P>0.05),不同发酵温度组内35℃的结果显著高于30℃和40℃(P<0.05),说明温度是影响发酵效果的主要因素,接种量和发酵时间影响较小。

表1 发酵方案正交试验设计及结果

表2 活菌总数主效应检验

故本试验后续样品根据正交试验结果,以6%的接种量在35℃分别培养48、72、96 h时取样,分别命名样品1、样品2和样品3,进行野尻霉素提取和测定试验。

2.2 发酵对盐酸提取法DNJ提取量的影响 由表3可知,盐酸提取法在不同发酵条件下DNJ提取量由高到低为:发酵样品3>发酵样品2>发酵样品1>空白对照>阴性对照。发酵样品3的DNJ提取量最高,为(1.44±0.03)mg/g,比空白对照组高13.39%,显著高于其他样品的DNJ提取量 (P<0.05)。 对照组的 DNJ提取量最低,为(1.27±0.06)mg/g,显著低于各组发酵样品DNJ提取量 (P<0.05)。发酵样品1和发酵样品2的DNJ提取量差异不显著(P> 0.05)。

2.3 发酵对水提取法DNJ提取量的影响 由表3可知,水提取法在不同发酵条件下DNJ提取量由高到低为:发酵样品3>发酵样品2>发酵样品1>空白对照>阴性对照。发酵样品3的DNJ提取量最高,为(1.35±0.06)mg/g,比对照组高 51.69%,显著高于其他样品的DNJ提取量(P<0.05)。对照组的 DNJ提取量最低,为(0.89±0.07)mg/g,显著低于发酵样品DNJ提取量(P<0.05)。而且,不同条件下的DNJ提取量均有显著差异(P<0.05)。

2.4 发酵对乙醇提取法DNJ提取量的影响 由表3可知,乙醇提取法在不同发酵条件下DNJ提取量由高到低为:发酵样品3>发酵样品2>发酵样品1>空白对照>阴性对照。发酵样品3的DNJ提取量最高,为(1.58±0.03)mg/g,提取量比对照组高17.03%,显著高于其他样品的DNJ提取量(P<0.05)。对照组的DNJ提取量最低,为(1.35±0.07)mg/g, 与发酵样品 1 的 DNJ提取量差异不显著 (P>0.05)。2.2~2.4结果说明,DNJ的提取量跟发酵时间的长短有很大关系,发酵时间长,微生物和酶作用的时间长,能够使DNJ更多的溶出,有利于提取,三种提取方法均是样品3(发酵时间长)的样品提取量最高。阴性对照采用相同发酵菌种和温度,发酵96 h,但结果并无明显的DNJ含量。说明,DNJ来源于蛋白桑,而与发酵菌种无直接关系。

2.5 提取方法对发酵样品DNJ提取量的影响由表3可知,对4个样品的提取均是醇提法效果最佳。对未经发酵处理的桑叶样品(对照)和发酵样品1乙醇提取法的提取效果最好,盐酸提取法的提取效果次之,水提取法的提取效果最差。醇提法和酸提法提取的DNJ含量显著高于水提法,但醇提取法和酸提取法的DNJ提取量差异不显著(P>0.05)。发酵样品2和发酵样品3用三种提取方法的DNJ提取量均差异显著(P<0.05)。醇提法最好,水提法最差。说明,醇作为有机溶剂更适合做小分子有机物DNJ的提取剂。

表3 提取方法对不同发酵样品DNJ提取量的影响mg/g

2.6 方法学考察结果

2.6.1 标准曲线线性 按照1.2.4的方法和色谱条件得到DNJ标准品色谱图和样品的DNJ色谱图,结果见图1。表明各成分分离良好。以标准品溶液浓度(X)为横坐标,色谱峰面积(Y)为纵坐标作图,得到回归方程Y=2584067X+743351,R2=0.9993,表明在0.34~17μg/mL具有良好的线性关系,结果见图2。

2.6.2 回收率和精密度 对发酵前蛋白桑中的DNJ进行加标处理,回收率试验结果如表4所示。由表4可知,样品平均回收率为98.6%,RSD为1.87%,说明回收率和精密度良好。

3 讨论与结论

表4 桑叶的加样回收率试验结果(n=9)

3.1 DNJ的提取方法 DNJ提取的方法很多,常用的有水提取法、盐酸提取法、乙醇提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等。曾锐等(2009)用水煎煮提取不同品种桑的不同部位,在不同桑粉中的DNJ含量差异较大,验证了方法的可靠性。刘凡等(2012)用0.05 mol/L的盐酸溶液对不同桑树品种桑叶DNJ进行提取,获得了较高的提取量。刘伟鋆等(2009)用70%的乙醇提取桑叶中的DNJ,提取液经过纯化后,得到DNJ含量为23.2%。胡瑞君等(2007)在提取桑叶中的DNJ时,以微波处理作为辅助条件,优化了微波处理工艺,提高了提取量。郑晓静等(2012)在提取桑叶中的DNJ时,以超声波处理作为辅助条件,优化了超声波提取条件,提高了DNJ的提取量。说明不同的提取方法均具有一定的可行性,但结果存在差异,若通过不同的预处理方式,则可以对DNJ提取产生影响。本试验分别选用了水提取法、盐酸提取法和乙醇提取法三种方法提取蛋白桑样品中的DNJ,并对相同样品中DNJ的提取量进行了比较,结果发现盐酸提取法和乙醇提取法的DNJ提取量明显高于水提取法,这是因为DNJ是一种分子量很小的生物碱类化合物,易溶于酸性溶液,而乙醇对植物细胞有较强的穿透力,这都有利于对DNJ的提取。

3.2 发酵对DNJ含量的影响 DNJ的提取量除了受提取方法影响外,预处理方式对其影响也较大。发酵作为一种对桑叶的处理方式也能够影响桑叶中DNJ的提取量。肖洪等(2013a、2013b)用混合霉菌对桑叶进行发酵,探讨了不同菌种比例及不同发酵条件(发酵时间和发酵温度)对发酵桑叶茶中的多糖、多酚和DNJ含量的影响,结果发现不同的菌种比例和不同的发酵条件下桑叶茶中的DNJ含量均存在差异。杨清等(2010)探讨不同发酵条件对桑红茶中生物活性成分含量的影响发现,随着发酵时间延长,游离氨基酸和DNJ含量逐渐增加。孙国霞等(2011)研究了黑曲霉在不同发酵温度对桑红茶中生物活性成分含量的影响,结果发现不同的发酵温度下桑红茶中的DNJ含量有所差异,最佳发酵温度为32℃。最优的发酵方案有利于主要发酵菌种的增殖和代谢,菌数的增加和代谢产物的分解作用是桑叶活性成分溶出的主要原因。现有的发酵方案,多是人的保健品上的数据和经验,发酵菌种也多是真菌中的霉菌 (孙国霞等,2011;杨清等,2010)。本试验以酵母菌和芽孢杆菌的混合菌液对蛋白桑进行发酵,延长发酵时间有利于发酵菌种增殖和代谢,破坏了桑叶的细胞壁,增加了发酵桑叶中的酸、酚、醇、酯等小分子物质含量(邹凡华和刘松青,2018;陆春霞等,2018),使 DNJ更容易溶出,通过发酵DNJ的提取量均得到了提高,丰富了蛋白桑的发酵参数和发酵菌种选择。

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