白及疫病防治药剂的筛选

何永林，霍 行，黎起秦，林纬，周琼，袁高庆*

(1.广西大学 农学院，广西 南宁 530004； 2.南宁市绿化工程管理中心， 广西 南宁 530011)

白及(Bletillastriata)又名“白芨”，为兰科白及属多年生草本植物。白及作为一种传统中药，具有多种药用成分和药理活性[1]。随着白及规模化人工种植面积的逐步扩大，白及病害逐渐增多。近几年，在广西桂林市资源县和南宁市白及种植基地发现，由烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)引起的白及疫病，危害叶片和近地面叶鞘，严重时致多张叶片枯死，部分田块植株发病率为10%～38%，对白及生产影响较大[2]。条件合适时白及疫病在田间蔓延速度很快，需要及时使用有效药剂进行控制。白及病害有根腐病(Fusariumoxysporum和F.solani)、块茎腐烂病(Rhizoctoniasolani)、叶褐斑病(Fusariumavenaceum)、灰霉病(Botrytiscinerea)、锈病(Coleosporiumbletilla)及叶斑病(Daldiniaconsentrica)[3]，尚未见有其他关于白及疫病以及防治方面的研究。已知引起白及疫病的烟草疫霉菌还可危害多种植物，其中以烟草黑胫病的研究报道居多。生产上防治烟草黑胫病的常用药剂有甲霜灵和烯酰吗啉，但近年来该病原菌已对其产生抗药性[4-5]。程东美等[6]发现，双炔酰菌胺、霜脲·锰锌、精甲霜·锰锌和噁霜·锰锌等药剂对烟草疫霉菌具有较好的抑菌效果，EC50在0.1～8.0 mg/L。烯酰·吡唑酯、氟菌·霜霉威和申嗪霉素对烟草黑胫病的防治效果达81.50%～91.43%，同时对烟株的生长有促进作用，可作为甲霜灵和烯酰吗啉的替代药剂[7-9]。霍行[10]研究白及疫病的病原菌及防治药剂发现，烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)是引起广西当地白及疫病的病原菌，有效浓度0.1 μg/mL的氟噻唑吡乙酮对病原菌的抑菌率达100%，有效浓度10 μg/mL的噁霜·锰锌、氟菌·霜霉威、烯酰吗啉·嘧菌酯、申嗪霉素和双炔酰菌胺等5种药剂对病菌菌丝生长有较好的抑制作用；氟噻唑吡乙酮对白及疫病病原菌的毒力作用最强，其EC50为0.014 2 μg/mL；盆栽试验结果表明，10%氟噻唑吡乙酮可分散油悬浮剂制剂量1.8 μL/m2的防治效果达72.05%。虽然对烟草疫霉菌所致其他植物病害有药剂防治的研究，但同种病原菌不同来源的菌株对药剂的敏感性可能存在差异，同种药剂对不同植物上的同类型病害也可能具有不同的防治效果。鉴于此，该研究以17种药剂为研究对象，采用菌丝生长抑制法与室内毒力测定、盆栽药效试验相结合的方法，筛选对白及疫病有效的杀菌剂及其适宜使用浓度，以期为田间白及疫病防治的药剂选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 白及疫病病原菌株烟草疫霉菌(P.nicotianae)，广西大学植物病理研究室提供。

1.1.2 白及品种 紫花大白及3叶期幼苗，由广西药用植物园提供。

1.1.3 供试药剂 22.5%啶氧菌酯SC，美国杜邦公司；40%嘧霉胺SC，江苏耘农化工有限公司；29%吡唑萘菌胺SC，瑞士先正达作物保护有限公司；40%噻呋酰胺SC，济南中科绿色生物工程有限公司；20%噻菌铜SC，浙江龙湾化工有限公司；30%吡唑醚菌酯SC，济南中科绿色生物工程有限公司；500 g/L抑霉唑EC，一帆生物科技集团有限公司；30%丙硫菌唑OD，安徽久易农业股份有限公司；64%噁霜·锰锌WP，先正达(苏州)作物保护有限公司；200 g/L氟唑菌酰羟胺SC，瑞士先正达公司；25%嘧菌酯SC，山东青岛凯源祥化工有限公司；68%精甲霜·锰锌WP，先正达(苏州)作物保护有限公司；94%氟嘧菌酯TC，德国拜耳作物科学有限公司；10%氟噻唑吡乙酮OD，美国杜邦公司；1%申嗪霉素SC，上海农乐生物制品股份有限公司；687.5 g/L氟菌·霜霉威SC，拜耳作物科学(中国)有限公司；50%烯酰吗·啉嘧菌酯WP，湖南农大海特农化有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

1) 白及疫病病原菌株的分离培养。2017年从广西桂林市资源县梅溪镇咸水口村白及种植基地采集表现典型症状的白及疫病病株，经分离、纯化及鉴定后获得目的菌株，菌株接种于V8斜面试管中25℃下保存，菌种贮藏在广西大学植物病理研究室。用灭菌接种针将保存的菌种移到V8(V8蔬菜汁200 mL，CaCO33 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH 7)平板上，25℃下恒温培养4 d后备用。

2) 白及栽培。将白及幼苗移栽于基质土中，置于28℃大棚，定期浇水，保持土壤湿润。待白及长至4～6片叶时用于药剂盆栽防治试验。

1.2.2 杀菌剂的室内筛选 采用生长速率法[4,10]测定17种杀菌剂对白及疫病病原菌的抑制作用。采用双因素试验设计，因素1为17种药剂；因素2为药剂浓度，每种药剂设置2个浓度，即10 μg/mL和1 μg/mL。在V8培养基中分别添加不同浓度的17种杀菌剂混合制成含药培养基平板，以添加等量无菌水的V8培养基为对照，各3次重复。用打孔器在供试菌株菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，将其接种到含药平板中央，28℃恒温培养4 d后用十字交叉法测量菌落直径(mm)，取其平均值，计算各药剂浓度对菌丝生长的抑制率。

抑菌率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5)]×100%

1.2.3 杀菌剂的毒力测定 从1.2.2的试验结果中选取对白及疫病病原菌生长抑制率为100%的杀菌剂及生产上防治疫病常用的噁霜·锰锌和精甲霜·锰锌进行室内毒力测定。各杀菌剂分别配置5个浓度，3次重复，以添加等量灭菌水为空白对照，参照上述方法测定不同药剂各浓度对病原菌的抑制率。将药剂浓度换算成浓度对数(x)，菌丝生长抑制率换算成抑制机率值(y)，计算各药剂的毒力回归方程、相关系数(r)及抑制中浓度(EC50)。测定4种杀菌剂在EC50下对白及疫病病原菌孢子囊的影响。方法同上，3次重复，以添加等量无菌水为空白对照。菌饼接种到含药平板在28℃下恒温培养7 d后，挑取大小5 mm×5 mm带菌培养基块置于载玻片上，用盖玻片轻轻压散培养基块，采用光学显微镜(10×10倍)观察统计各处理的孢子囊个数(每重复观察8个视野下的孢子囊个数)。

1.2.4 氟噻唑吡乙酮和申嗪霉素对白及疫病的盆栽防治效果 选择对白及疫病病原菌毒力较强的2种杀菌剂10%氟噻唑吡乙酮OD和1%申嗪霉素SC，测定其对白及疫病的盆栽防治效果。分别配制氟噻唑吡乙酮有效浓度为40 μL/L和60 μL/L，申嗪霉素有效浓度为17 μL/L和25 μL/L，以68%精甲霜·锰锌有效浓度2.4 g/L作为对照药剂。以喷施等量清水为空白对照。在白及长至4～6叶片时，每片叶接种1块白及疫病病原菌菌饼，3次重复，每重复接种10～15片叶，以接种无菌V8培养基为空白对照。药剂的施药方法设先施药后接种和先接种后施药2种方式。第1次施药分别在接种病原菌前24 h和接种后24 h进行；第2次施药均在接种6 d后进行。使用电动喷雾器施药，以叶面均匀喷施药剂至刚好有药液滴下为标准。第1次病情调查在接种后6 d进行，第2次调查在第2次施药后5 d进行，共调查2次。每小区调查10片叶，分别记载病叶数及其病级，计算每个处理的病情指数及防治效果[4，10]。病情分级标准[4，10]：0级：叶片无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积5%以下；3级：病斑面积占整个叶面积6%～11%；5级：病斑面积占整个叶面积11%～20%；7级：病斑面积占整个叶面积21%～50%；9级：病斑面积占整个叶面积50%以上。计算病情指数和防治效果。

病情指数=[∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查病叶数×最高级数值]×100

防治效果=[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100%

1.3 数据处理

采用Excel 2010和DPS 7.05对数据进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌剂的抑菌效果

从表1看出，17种杀菌剂对白及疫病病原菌的抑菌效果存在明显差异。随药剂有效浓度增加，各药剂的防效亦升高，浓度为10 μg/mL时，申嗪霉素和氟噻唑吡乙酮对白及疫病病原菌菌丝生长抑制效果最好，抑菌率达100%，显著高于其他处理；其次是烯酰吗啉·嘧菌酯、氟菌·霜霉威和噁霜·锰锌，抑菌率分别为79.33%、73.46%和65.76%，与其他处理的抑菌率差异显著；其余杀菌剂抑菌效果低或无抑菌效果。选择申嗪霉素和氟噻唑吡乙酮进行室内毒力测定，同时以生产上卵菌病害常用的药剂噁霜·锰锌和精甲霜·锰锌作为药剂对照。

表1 17种杀菌剂不同浓度处理对白及疫病病原菌的抑制率

2.2 不同杀菌剂的室内毒力

从表2可知，各药剂浓度对数(x)与菌丝生长抑制机率值(y)间均存在良好的线性关系，相关系数均在0.99以上。其中，氟噻唑吡乙酮的抑菌效果最强，EC50为0.014 2 μg/mL，申嗪霉素、噁霜·锰锌抑菌效果其次，EC50分别为1.286 4 μg/mL和11.156 7 μg/mL，精甲霜·锰锌的抑菌效果最差，EC50为2 210.604 6 μg/mL。在10×10倍视野下，氟噻唑吡乙酮、申嗪霉素、噁霜·锰锌、精甲霜·锰锌和清水对照处理的平均孢子囊个数分别为2.04个、5.83个、65.29个、65.88个和66.29个。表明，氟噻唑吡乙酮和申嗪霉素对孢子囊的产生有较强的抑制作用，其中，氟噻唑吡乙酮的抑制效果最明显，显著高于其他药剂；申嗪霉素其次，与其他处理差异显著；噁霜·锰锌和精甲霜·锰锌对孢子囊的产生无抑制作用或影响较小。

表2 4种杀菌剂对白及疫病病原菌的室内毒力

2.3 氟噻唑吡乙酮和申嗪霉素对白及疫病的盆栽防治效果

从表3看出，各杀菌剂处理对白及疫病的防效随着施药次数的增加均有一定的提升。预防试验(接种白及疫病病原菌前24 h施药)第2次施药后5 d，10%氟噻唑吡乙酮对白及疫病的防效最好，有效浓度为40 μL/L和60 μL/L的防效分别为95.11%和95.33%，2组处理间防效差异不显著，但均显著高于其余处理；1%申嗪霉素有效浓度17 μL/L和25 μL/L的防效分别为60.16%和71.49%；对照药剂68%精甲霜·锰锌水分散粒剂有效浓度2.4 g/L的防效最低，为36.94%；治疗试验(接种白及疫病病原菌后24 h施药)第2次药后5 d，10%氟噻唑吡乙酮有效浓度60 μL/L对白及疫病的防效最好，其防效为72.36%，显著高于其余处理；10%氟噻唑吡乙酮有效浓度40 μL/L和1%申嗪霉素有效浓度25 μL/L处理间防效未达差异显著水平，但显著高于1%申嗪霉素有效浓度25 μL/L和对照药剂68%精甲霜·锰锌水分散粒剂有效浓度2.4 g/L的防效；对照药剂68%精甲霜·锰锌水分散粒剂有效浓度2.4 g/L的防效最低，为38.13%。氟噻唑吡乙酮在白及疫病病原菌入侵前施药效果更明显。

表3 接种白及疫病病原菌前后24 h施杀菌剂对盆栽白及疫病的防治效果

3 结论与讨论

精甲霜·锰锌和噁霜·锰锌是一类保护性和内吸性的混合杀菌剂，能有效缓解病菌产生抗药性，对烟草疫霉菌具有较好的室内抑菌活性和田间防效[6]。研究结果表明，噁霜·锰锌和精甲霜·锰锌对白及疫病病原菌的抑菌效果不理想，Ec50分别为11.156 7 μg/mL和2 210.604 6 μg/mL，精甲霜·锰锌对白及疫病的盆栽防效也仅为36%左右，可能是因为不同病原菌株之间对药剂敏感性差异、药剂在不同植物中的渗透和传导性能不同所致[11]。

研究表明，申嗪霉素和氟噻唑吡乙酮对白及疫病病原菌均具有较好的离体和活体抑制作用，尤其是氟噻唑吡乙酮的作用更强，EC50为0.014 2 μg/mL，防效达95.33%。申嗪霉素是一种抗生素，其作用机理为通过抑制真菌活性氧的积累进一步抑制线粒体中呼吸传递链的氧化磷酸化作用，从而抑制菌丝生长，目前广泛应用于防治真菌性根腐和茎腐病[12]，也可防治由疫霉引起的辣椒疫霉型根腐病、烟草黑胫病和马铃薯晚疫病等病害，田间防治效果优于精甲霜·锰锌和恶霜灵等传统内吸性杀菌剂[13-15]。申嗪霉素在白及疫病病原菌入侵前后施用的防效在69%左右，均比精甲霜·锰锌高。

新型杀菌剂氟噻唑吡乙酮为卵菌氧化固醇结合蛋白抑制剂[16]，对卵菌病原体引起的植物病害具有特殊活性[17]。目前国内已用于马铃薯晚疫病、黄瓜霜霉病及葡萄霜霉病等卵菌病害的田间防治[18-20]，但尚未有用于防治烟草疫霉菌引起病害的报道。BITTNER等[21]首次在美国测试了氟噻唑吡乙酮对烟草黑胫病菌(P.nicotianae)的毒力，其对病菌菌丝生长和孢子囊形成的Ec50分别为0.003 9～0.004 9 μg/mL和0.000 52～0.000 81 μg/mL，氟噻唑吡乙酮在田间防治烟草黑胫病同样具备较好的效果。研究表明，氟噻唑吡乙酮对烟草疫霉菌菌丝生长和孢子囊产生具有较强的毒力作用，盆栽防治效果较好，在白及疫病病原菌入侵前施药效果更明显，有效浓度为40 μL/L时防效达95.11%，与前人研究结果一致。但申嗪霉素和氟噻唑吡乙酮对白及疫病的田间防治效果还有待进一步研究验证。

该试验明确了氟噻唑吡乙酮和申嗪霉素对白及疫病病原菌具有较强的室内毒力作用，对盆栽条件下的白及疫病具有较好的防治效果，且氟噻唑吡乙酮在白及疫病病原菌入侵前施用效果更好，研究结果可为田间白及疫病的防治药剂提供参考依据。