D-二聚体2种检测方法的参考值建立和排除静脉血栓栓塞症临界值设定*

张鸿艳，任静，杨晴，门剑龙(天津医科大学总医院精准医学中心，天津300052)

D-二聚体是反映凝血活化和继发性纤溶亢进的标志物，其血浆浓度与血管内纤维蛋白负荷密切相关，在临床上已成为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，VTE)排除诊断和风险评估的重要指标[1-2]。目前，国内实验室主要用高敏微粒凝集定量法和酶联免疫荧光法检测D-二聚体，应用效果良好。近年来，又出现了2种D-二聚体检测系统，分别是采用纤维蛋白原等量单位(fibrinogen equivalent units，FEU)的化学发光法和采用D-二聚体单位(D-dimer units，DDU)的胶乳免疫比浊法。根据文献[3-4]，这2种方法的健康人参考值和排除诊断临界值有别于既往的D-二聚体检测方法，尤其缺乏中国人群的基线数据，且由于在临床上的应用时间较短，实验室对其在辅助临床诊断方面的敏感性和特异性也了解不足。因此，本研究通过2个亚组研究，分析2 431例不同年龄的健康人、200例VTE患者以及200例非VTE疾病患者的血浆D-二聚体数据，初步获得2种新型D-二聚体检测方法的健康人参考值、排除VTE临界值及其诊断性能。

1 材料与方法

1.1研究对象

1.1.1健康人第1组 收集2015年1月—2016年1月天津医科大学总医院的体检健康者1 207例，男601例，女606例，年龄20～69岁。排除标准：酗酒史、3个月内献血、高血压、肝肾疾病、全身炎性疾病、血液系统疾病、内分泌系统疾病、哺乳期、妊娠、肥胖、吸烟、3个月内的用药史和手术史。标本用于建立化学发光法参考值。

1.1.2健康人第2组 收集2016年1月—12月天津医科大学总医院的体检健康者1 224例，男609例，女615例，年龄20～68岁，排除标准同1.1.1。标本用于建立免疫比浊法参考值。

1.1.3VTE患者组 选择2015年3月—2016年12月天津医科大学总医院收治的初诊患者200例，男100例，女100例，年龄(55.2±9.4)岁，其中致死性肺栓塞(pulmonary embolism，PE)患者27例，非致死性PE患者22例，下肢深静脉血栓(deep venous thrombosis，DVT)合并PE患者16例，DVT患者135例；诊断经血管造影、超声、计算机断层扫描或肺通气/灌注扫描证实，符合《肺血栓栓塞症诊治与预防指南》和《中国血栓性疾病防治指南》关于急性静脉血栓栓塞症的诊断标准[1-2]。

1.1.4非VTE疾病对照组 选择2015年3月—2016年12月天津医科大学总医院收治的患者200例，男99例，女101例，年龄(55.6±9.2)岁，其中急性冠脉综合征患者71例，普通外科术后患者66例，创伤患者61例，诊断均经临床、实验室及影像学检查证实。入组患者除外活动性恶性肿瘤和妊娠期患者。非VTE疾病对照组与VTE患者组的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过天津医科大学总医院伦理委员会审批(ZYY-JY-2017-01)。

1.2方法 静脉血标本以枸椽酸钠抗凝(109 mmol/L，3.2%)按1∶9进行抗凝，2 664×g离心10 min，取上层乏血小板血浆进行测定，于采集后4 h内测定血浆D-二聚体。(1)化学发光法：在美国Instrumentation Laboratoy公司ACL AcuStar化学发光仪上用其配套HemosIL®AcuStar D-dimer试剂盒测定，按说明书进行操作；(2)胶乳免疫比浊法：在日本积水公司CP 2000型全自动血液凝固仪上用其配套试剂盒测定，按说明书进行操作。

1.3统计学分析 用SPSS 17.0统计软件进行。偏态分布数据以中位数(四分位数)[M(P25，P75)]表示，多组间数据比对采用Kruskal-WallisH检验，两组间数据比较采用Mann-WhitneyU检验，以P<0.05为差异有统计学意义。采用ROC曲线评价D-二聚体的诊断性能。

2 结果

2.1健康人第1组化学发光法D-二聚体测定结果

2.1.1各年龄段不同性别间结果比较 在20～30岁组、31～40岁组、41～50岁组、51～60岁组中，女性的血浆D-二聚体水平均高于男性，差异均有统计学意义(P值分别为<0.001、<0.001、<0.001和0.012)；在≥61岁组中，男、女健康人间差异无统计学意义(P=0.114)。见表1。

表1 健康人第1组化学发光法D-二聚体检测结果(ng/mL FEU，M[P25，P75])

2.1.2健康人第1组不同年龄段间结果比较 健康人第1组血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高，各年龄段间差异有统计学意义(χ2=159.088，P<0.001)。其中20～30岁组与31～40岁组比较、31～40岁组与41～50岁组比较，差异无统计学意义(U值分别为28 721和26 321，P均>0.05)；41～50岁组与51～60岁比较、51～60岁组与≥61岁组比较，差异有统计学意义(U值分别为22 070和2 262，P均<0.001)。

2.1.3男性健康人群不同年龄段间结果比较 男性健康人总体血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高，各年龄段间差异有统计学意义(χ2=134.853，P<0.001)。男性20～30岁组与31～40岁组比较，差异无统计学意义(U=7 126，P=0.890)；31～40岁组与41～50岁组比较、41～50岁组与51～60岁组比较、51～60岁组与≥61岁组比较，差异有统计学意义(U值分别为5 839、4 704和5 602，P均<0.05)。

2.1.4女性健康人群不同年龄段间结果比较 女性健康人总体血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高，各年龄段间差异有统计学意义(χ2=44.330，P<0.001)。女性20～30岁组与31～40岁组比较、31～40岁组与41～50岁组比较，差异无统计学意义(U值分别为7 129、7 200，P均>0.05)；41～50岁组与51～60岁组比较、51～60岁组与≥61岁组比较，差异有统计学意义(U值分别为6 335和5 675，P均<0.05)。

2.2健康人第2组免疫比浊法D-二聚体测定结果

2.2.1各年龄段不同性别间结果比较 在20～30岁组、31～40岁组、41～50岁组、51～60岁组中，女性的血浆D-二聚体水平均高于男性，差异均有统计学意义(P<0.001)；在≥61岁组中，男、女健康人间差异无统计学意义(P=0.125)，见表2。

表2 健康人第2组免疫比浊法D-二聚体检测结果(ng/mL DDU，M[P25，P75])

2.2.2总人群不同年龄段间结果比较 健康人血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高，各年龄段间差异有统计学意义(χ2=89.634，P<0.001)。其中20～30岁组与31～40岁组比较、41～50岁组与51～60岁比较，差异无统计学意义(U值分别为30 307和27 526，P均>0.05 )；31～40岁组与41～50岁组比较、51～60岁组与≥61岁组比较，差异有统计学意义(U值分别为23 300和22 953，P均<0.05)。

2.2.3男性健康人群不同年龄段间结果比较 男性健康人总体血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高，各年龄段间差异有统计学意义(χ2=126.779，P<0.001)。男性20～30岁组与31～40岁组比较、41～50岁组与51～60岁组比较，差异无统计学意义(U值分别为7 102、6 270，P均>0.05)；31～40岁组与41～50岁组比较、51～60岁组与≥61岁组比较，差异有统计学意义(U值分别为5 466和3 812，P均<0.05)。

2.2.4女性健康人群不同年龄段间结果比较 女性健康人总体血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高，各年龄段间差异有统计学意义(χ2=14.207，P<0.007)。女性20～30岁组与31～40岁组比较、41～50岁组与51～60岁组比较、51～60岁组与≥61岁组比较，各组间差异均无统计学意义(U值分别为8 030、7 424和6 728，P均>0.05)；31～40岁组与41～50岁组比较，差异有统计学意义(U=5 821，P=0.005)。

2.32种D-二聚体检测方法的参考值 根据2.1～2.2数据，初步获得2种D-二聚体检测方法的参考值(计算95%百分位数上侧限值)。化学发光法(ACL AcuStar化学发光仪)总体人群为<528 ng/mL，其中≤50岁男性为<271 ng/mL，>50岁男性为<637 ng/mL；≤50岁女性为<441 ng/mL，>50岁女性为<673 ng/mL。免疫比浊法(CP 2000型全自动血液凝固仪)总体人群为<780 ng/mL，其中≤50岁男性为<650 ng/mL，>50岁男性为<802 ng/mL；≤50岁女性为<810 ng/mL，>50岁女性为<830 ng/mL。

2.4D-二聚体排除诊断VTE的临界值和诊断性能 200例非VTE疾病对照组和200例VTE患者组以化学发光法测定的D-二聚体结果分别为2 344(205，10 123) ng/mL FEU和2 525(509，13 734)ng/mL FEU，以免疫比浊法测定的D-二聚体结果分别为2 490(327，14 249)ng/mL DDU和3 156(636，17 168)ng/mL DDU。将VTE组、非VTE疾病对照组患者的D-二聚体检测结果与健康人数据置于同一数据集内，用ROC曲线分析2种方法对VTE的排除诊断性能，见表3。

表3 2种D-二聚体检测方法排除诊断VTE的ROC曲线分析结果

3 讨论

D-二聚体是排除诊断静脉血栓和监测血栓风险的重要指标，广泛应用于临床各个学科。作为一种纤维蛋白降解产物，D-二聚体片段有很强的异质性，使得不同试验方法检出的D-二聚体类型差异较大，至今尚未实现标准化，其测定结果有ng/mL、μg/mL和mg/L等多种报告方式，且结果定义也不一致(包括FEU和DDU 2种形式)，因此源自不同方法学的数据不能进行相互换算和横向比对[5]。

基于既往资料，D-二聚体数据属于偏态分布，根据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)关于参考值设定的C28-A2文件，偏态分布数据在制定参考值时，样本数量应多于正态分布数据(≥100例)，采用百分位数法，以增高为异常。本研究中的各个年龄段均纳入>198个观察个体，其中各年龄段内的性别亚组均纳入>100例观察个体，可以满足计算95%百分位数上侧界值的要求。

既往研究发现，老年人的血浆D-二聚体水平高于青壮年人群[4-6]，本研究再次验证了这一现象。结果显示，化学发光法和免疫比浊法的D-二聚体检测结果均表现出随年龄逐渐增高的特点，且各年龄段的多组间比较显示差异有统计学意义(P<0.001)，其中20～30岁组D-二聚体水平与31～40岁组差异无统计学意义，表明20～40岁健康人群的止凝血功能状态相对稳定，上述特征在2个检测系统、不同性别人群中表现一致。

在20～30岁组、31～40岁组、41～50岁组、51～60岁组中，女性的血浆D-二聚体水平都高于男性且差异有统计学意义。化学发光法检测总体人群参考值为<528 ng/mL，在≤50岁人群和>50岁人群中，女性参考值(< 441 ng/mL和<673 ng/mL)均高于男性(<271 ng/mL和<637 ng/mL)；免疫比浊法的参考值特征也表现出相同的趋势，总体人群参考值为<780 ng/mL，女性参考值(810 ng/mL和830 ng/mL)高于男性(650 ng/mL和802 ng/mL)，其原因可能与雌激素水平相关[7-9]。

此外，在≥61岁组，男、女性别间的差异无统计学意义，则进一步提示随年龄增长，导致凝血活化的因素逐渐增多，D-二聚体水平随之增高，在高龄人群中，血浆D-二聚体浓度可能受到基于血管因素和血液流动力学的多方面影响，从而掩盖了性别间的水平差异。需注意，虽然2种实验方法的测定结果均显示出现血浆D-二聚体浓度随年龄增高的现象，但二者在各年龄段的趋势特征有所不同，例如化学发光法的D-二聚体水平在51～60岁与≥61岁的女性人群比较中差异有统计学意义，但在免疫比浊法的数据中则无统计学意义。本研究认为其原因可能与2种方法所检出的不同D-二聚体片段在血浆中浓度存在差异有关，同时也不能排除是来自不同亚组人群样本所造成的误差，因此尚需更多临床观察进行验证。

既往研究表明，血浆D-二聚体浓度随年龄增加会降低其排除诊断VTE的特异性，因此对于50岁以上的低度VTE临床可能性患者，宜采用“年龄×10 ng/mL”的方式上调临界值以提高诊断性能(在维持高敏感性的基础上，提高特异性)[6-11]，2014年《欧洲心脏病学会(European Society of Cardiology，ESC)急性肺栓塞诊断和用药指南》[12]、2018年《中国血栓性疾病防治指南》[1]、《肺血栓栓塞症诊治与预防指南》[2]、2019年《ESC急性肺栓塞诊断和用药指南》[13]均推荐该模式用于VTE的排除诊断。ROC分析显示，2种D-二聚体检测方法在各年龄段人群中，VTE排除诊断的临界值均随年龄增加而提高，且都有很好的敏感性和阴性预测值(但诊断敏感性在高龄人群中有所降低)，并保持相对稳定的特异性和阳性预测值，这一特征与既往其他方法学研究一致[6-11]，实验室应结合自身技术平台、患者群以及疾病分布特征制定适合本医疗机构的临界值[1-2,14-16]。此外，由于不同方法检测的D-二聚体在年龄变化趋势上存在一定性别差异，提示临床在评估数据的临床意义时，应事先了解本机构实验室的方法学类型。

综上所述，虽然化学发光法与免疫比浊法在检测原理、结果定义等方面有显著差异，但二者在健康人群中的总体数据分布特征相近，对VTE排除诊断均具有高度敏感性和良好的阴性预测值，表明这2种方法可安全用于VTE的排除诊断。