乌苏里貉KIT基因及编码蛋白生物信息学分析

白秀娟，姜恩泽，苏 杭，朱宇航，许 愿，徐逸男，李 雪，韩志强，徐 超

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨，150030；2.中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

KIT基因，又名c-KIT基因，编码的肥大/干细胞生长因子受体（Mast/stem cell growth factor receptors）最初于猫肉瘤病毒中被发现[1]。在色素沉着方面，KIT基因主要调控黑色素细胞前体沿特定路径迁移到真皮、表皮、内耳和眼脉络膜的过程[2]。KIT基因非正常编码或表达量较少时，黑色素细胞不会正常增殖和迁移，机体产生不同程度白化[3]。白癜风患者KIT基因表达量极显著低于正常人[4]。目前，KIT基因在动物中已发现多种突变体。狐狸白色被毛与KIT基因外显子12缺失有关[5]。KIT基因易位使牛表现不同程度白斑[6]。阿拉伯骆驼白色斑点与KIT基因突变有关[7]。研究表明KIT基因在毛色调控中发挥重要作用。

乌苏里貉（Nyctereutes procyonoides）属于犬科（Canidae），经济价值较高的毛皮动物。研究表明野猪KIT基因与毛色表型不相关[8]，乌苏里貉KIT基因编码区未发现与毛色相关单核苷酸位点[9-10]，乌苏里貉KIT基因与毛色关系未见报道，为了解乌苏里貉KIT基因及编码蛋白结构特性，基于机器学习和人工神经网络等在线软件对其编码蛋白一级、二级、三级结构作全面生物信息学分析。研究结果旨在比较乌苏里貉与其他动物KIT基因提供参考，为了解KIT基因潜在功能提供新思路。

1 材料与方法

1.1 KIT基因转录本定量

根据中国农业科学院特产研究所上传到SRA数据库的乌苏里貉皮肤转录组数据:野生貉（SRS1620675，SRS1620679，SRS1620678），白貉（SRR4158185，SRR4158184，SRR4158183），红棕貉（SRR4034955， SRR4034954，SRR4034953）各3只，原始数据均由Illumina HiSeqTM 2000双端测序获得，按文献[11]方法分析转录本数据。为获得clean reads便于后续分析，将接头、低质量序列和未知核苷酸序列过滤，使用Trinity软件序列组装，获得尽可能长非冗余unigenes。通过Bowtie软件比对unigenes。使用RSEM工具精确量化每个样本转录丰度。使用FPKM方法计算每个转录产物基因表达水平。最后，分别提取不同毛色乌苏里貉KIT基因表达量方差分析。

1.2mRNA序列收集

从GenBank数据库检索已公布的乌苏里貉KIT基因mRNA序列，登录号:KM083121，保存完整CDS序列，以便进一步生物信息学分析。

1.3 乌苏里貉KIT基因序列分析

使用DNAMAN软件中display sequence程序分析CDS序列总长度及4种碱基含量。通过在线软件ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析CDS区开放阅读框。

1.4 乌苏里貉KIT基因编码蛋白一级结构预测

为了解乌苏里貉KIT基因编码蛋白一级结构特征，运用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）在线软件预测KIT基因编码蛋白理化性质。运用基于Hphob./Kyte＆Doolittle模型在线软件Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）预测KIT蛋白亲水性和疏水性。运用在线软件NetOGly 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和 NetNG-ly 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNG-lyc/）分别预测KIT蛋白O-糖基位点和N-糖基位点。最后，使用在线软件NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测乌苏里貉KIT蛋白磷酸化位点[12]。

1.5 乌苏里貉KIT基因编码蛋白二级结构及定位分析

使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线软件预测乌苏里貉KIT蛋白二级结构[12]。运用在线软件SingalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）定 位分析KIT蛋白信号肽[13]。通过TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线工具预测分析KIT蛋白质跨膜区位置[14]。通过在线软件PSORT（https://www.genscript.com/psort.html）和 Softberry（http://linux1.softberry.com/）网站预测KIT蛋白亚细胞定位。通过NCBI Conserved Domain（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）寻找KIT蛋白保守结构域[13]。

1.6 乌苏里貉KIT基因编码蛋白三级结构及蛋白互作分析

通过SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）网站构建KIT蛋白三级结构模型。运用 STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）交互数据库分析与KIT蛋白密切作用的蛋白质。

1.7 不同物种KIT基因编码蛋白序列进化分析

根据乌苏里貉KIT蛋白序列，运行BLAST，获得家犬（AAD28369.1，Canis lupus familiaris）、家猫（NP_001009837.3，Felis catus）、野猪（AFK92989.1，Sus scrofa）、牦牛（XP_005905988.1，Bos mutus）、藏羚羊（XP_005961702.1，Pantholops hodgsonii）、家 马（NP_001157338.2，Equus caballus）、 家 牛（XP_005207994.2，Bos taurus）7个物种KIT蛋白序列，运用在线软件Clustal Omeaga（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）对8个物种KIT蛋白序列比对分析，通过MEGA5.1软件中邻近法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 3种毛色KIT基因定量表达

在3种毛色乌苏里貉转录本定量表达中，白貉KIT基因表达量最高，为1.4746，其次为红棕貉（0.0748），野生貉KIT基因表达量最低（0.0246），且白貉KIT基因表达量显著高于红棕貉和野生貉（P＜0.05）。

2.2 乌苏里貉KIT基因序列

DNAMAN序列分析结果显示，乌苏里貉KIT基因CDS区长度为2 919 bp，4种碱基含量依次为A（27.4%，800）＞T（25.6%，748）＞G（24.6%，719）＞C（22.4%，652），其中A+T含量（53%）略高于G+C含量（47%），说明该基因稳定性较差，ssDNA分子质量为902.77，dsDNA分子质量为1 799.47。ORF finder开放阅读框预测结果显示，起始密码子ATG编码Met，终止密码子TGA不编码氨基酸，该序列共编码972个氨基酸。

2.3 乌苏里貉KIT基因编码蛋白一级结构特性

2.3.1 理化特性

在线工具Protparam分析理化性质结果表明，乌苏里貉KIT基因编码蛋白分子式为C4863H7546N1294O1451S52，由15 206个原子组成，分子质量为109 022.33，消光系数在280 nm处测量值为135 120，推测乌苏里貉体内半衰期为30 h，不稳定指数为37.79（＜40），为稳定氨基酸，脂肪族氨基酸指数为81.39，该蛋白质序列等电点为6.15，属于酸性蛋白质。

2.3.2 亲水性和疏水性

在线工具Proscal分析亲水性和疏水性结果表明，乌苏里貉KIT基因编码蛋白中疏水性氨基酸（Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro）399个，亲水性氨基酸（Gly、Thr、Ser、Cys、Asn、Gln、Tyr、Lys、Arg、His、Asp、Glu）573个，其中，第14位氨基酸为最大疏水性氨基酸（3.589），第364位氨基酸为最大亲水性氨基酸（-2.789），且亲水性氨基酸（＜0）多于疏水性氨基酸（＞0），平均亲水系数为负值（-0.224），因此该蛋白质是亲水性蛋白质，结果见图1。

2.3.3 乌苏里貉KIT蛋白的糖基位点和磷酸化位点预测

在线软件NetOGly 4.0 Server分析结果显示，乌苏里貉KIT蛋白共存在12个O-糖基位点，分别在第 28、 30、 38、 709、 939、 950、 955、 958、959、961、962、963位氨基酸。NetNGly 1.0 Server分析结果表明，乌苏里貉KIT蛋白共存在9个N-糖基位点，位置分别在第94、130、145、283、300、352、367、400、486位氨基酸。通过Net-Phos分析磷酸化位点结果发现，乌苏里貉KIT蛋白共60个磷酸化位点分值高于0.5，其中包括35个丝氨酸（Ser）、10个苏氨酸（Thr）、15个酪氨酸（Tyr），具体位置如表1所示。

2.4 乌苏里貉KIT蛋白二级结构分析

通过SOPMA在线软件预测乌苏里貉KIT蛋白二级结构。预测结果显示，该蛋白有247个（25.41%）氨基酸形成α螺旋；220个（22.63%）氨基酸形成延伸直链；50个（5.14%）氨基酸形成β-转角；455个（46.81%）氨基酸形成无规卷曲，因此无规卷曲为乌苏里貉KIT蛋白主要二级结构。

2.5 预测乌苏里貉KIT蛋白结构及定位

2.5.1 信号肽和跨膜区

在线分析软件TMHMM预测该蛋白存在两个跨膜区结构，分别在第517～539、649～671位氨基酸，其余第1～516、672～972位氨基酸位于细胞膜外侧，第540～648位氨基酸位于细胞膜内侧（见图2）。

在线SignalP软件预测该蛋白质信号肽结果显示，该蛋白在第1～25位氨基酸为信号肽序列，因此推测该蛋白为分泌型蛋白（见图3）。

2.5.2 保守结构域

NCBI Conserved Domain预测结果表明，乌苏里貉KIT蛋白共有4个保守结构域，包括2个免疫球蛋白结构域（Ig），分别位于第216～305、426～505位氨基酸残基，1个干细胞因子受体第四免疫球蛋白样域（Ig4_SCFR），位于第311～411位氨基酸残基，1个蛋白激酶C（PKc-like），位于第549～924位氨基酸残基（见图4）。

2.5.3 亚细胞定位

在线软件PSORT预测乌苏里貉KIT基因编码蛋白亚细胞定位结果显示，该蛋白存在于内质网（21.7%）、高尔基体（13.0%）、细胞膜（34.8%）、细胞外（30.4%），Softberry网站分析该蛋白定位在细胞膜上评分为10.0（满分）。

2.6 乌苏里貉KIT蛋白同源建模

通过SWISS-MODEL对乌苏里貉KIT蛋白同源建模，系统根据蛋白质结构域将乌苏里貉KIT蛋白分为两大板块。根据乌苏里貉KIT蛋白第33～507位氨基酸同源建模获得三级结构，如图5a所示，包含KIT蛋白2个Ig和1个Ig4_SCFR。根据乌苏里貉KIT蛋白第547～927位氨基酸同源建模获得三级结构，如图5b所示，包含1个PKc-like。

2.7 KIT蛋白互作网络

运用STRING预测与KIT蛋白相互作用蛋白质，如图6所示，其中共有5个蛋白相关系数在0.950以上，包括KIT配体（KITLG），相关系数0.998；磷酸肌苷-3激酶（PIK3R1)，相关系数0.962；磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3激酶（PIK3CA），相关系数0.961；还有两个RAS家族原癌基因NRAS、HRAS，相关系数分别为0.960、0.957。

2.8 系统发育树构建

通过邻近法构建系统发育树，其中重复参数为1 000，采用邻近法计算距离，从系统发育树中可见，如图7所示，乌苏里貉和家犬进化距离较近，与家猫聚合为1支，家牛、牦牛、藏羚羊、野猪、家马聚合为另1支。

3 讨论

3.1 乌苏里貉KIT基因表达量与黑色素含量关系

黑色素细胞起源于胚胎发育时神经嵴细胞，KIT基因可调控神经嵴细胞分化、存活和迁移[15-16]，是黑色素细胞成熟关键。理论上，KIT基因表达量较多利于黑色素细胞成熟，可产生较多黑色素，机体颜色加深。斑嘴野鸭KIT基因在褐羽和黄白羽中表达量均显著高于白羽（P＜0.05）[17]，骝色蒙古马KIT基因表达量极显著高于白色蒙古马（P＜0.01）[3]，Du等研究结果表明，白貉被毛中黑色素含量显著低于野生貉[11]。3种毛色乌苏里貉转录本定量结果表示，KIT基因在白貉中表达量最高，其次是红棕貉，而野生貉KIT基因表达量最低，与乌苏里貉KIT基因表达量和毛色表型关系不符，可能是乌苏里貉KIT基因及其编码蛋白结构与其他动物不同所致。

3.2 乌苏里貉KIT蛋白结构分析

文章从全球最大基因数据库GenBank中检索到乌苏里貉KIT基因CDS序列作生物信息学分析，结果表明，KIT基因CDS序列全长2 919 bp，共编码972个氨基酸。使用TMHMM和SignalP在线网站，基于神经网络算法分别精准预测蛋白质跨膜区和信号肽，根据分析结果推测该信号肽位于氨基酸序列N端且分布在细胞膜外侧，信号肽可调控大多数蛋白质分泌[18-19]。根据跨膜区和结构域分析结果，2个Ig和1个Ig4_SCFR位于氨基酸序列N端且分布在细胞膜外侧，1个PKc-like位于氨基酸序列C端且分布在细胞膜外侧。根据跨膜区和糖基化分析结果预测，O-糖基和N-糖基全部在细胞膜外侧，且O-糖基主要分布在氨基酸序列C端，少数分布在N端。N-糖基分布在氨基酸序列N端。乌苏里貉KIT蛋白首先在内质网中作N端糖基化修饰，再转运到高尔基体中作复杂的糖基化修饰，最后到细胞膜表面表现生物学功能[20-21]。Softberry和PSORT为预测蛋白质亚细胞定位常用在线网站，Softberry网站功能全面，预测结果以评分表示，内容较详细。PSORT网站功能较单一，预测结果百分比表示。通过PSORT网站对乌苏里貉KIT蛋白亚细胞定位预测分析结果显示，该蛋白质主要在细胞膜上发挥功能，与Softberry预测结果一致。根据跨膜区和磷酸化分析结果，KIT蛋白磷酸化位点有7个在细胞膜内侧，53个在细胞膜外侧，其中氨基酸序列N端存在30个，氨基酸序列C端存在23个，两个跨膜区均不存在磷酸化位点。因此，研究结果阐明乌苏里貉KIT基因编码蛋白的性质，可为进一步研究提供参考数据。

3.3 KIT基因及蛋白序列比较分析

根据BLAST分析结果构建系统发育树，发现乌苏里貉、家犬和家猫聚合为一大支，表明乌苏里貉KIT蛋白结构与家犬、家猫相似。红褐貉第二外显子长为276 bp，与家犬、家猫同源性分别为97%、92%，且对野生貉、白貉、红褐貉第二外显子分析未发现突变位点[9]，张巧灵等分析羊驼KIT基因exon10-19表明，其酪氨酸激酶活性位点仅横跨12个氨基酸，而乌苏里貉酪氨酸激酶549～924位于氨基酸残基之间[22]，约占KIT蛋白总长度一半。不同动物KIT蛋白结构不同，酪氨酸激酶结构域活性可影响KIT蛋白磷酸化，磷酸化转化调控对干细胞迁移和下游信号转导具有关键作用[23]。在具有白色斑点的冰岛马皮肤中发现，KIT基因17号外显子中缺失一个碱基，证实该缺失可阻碍黑色素细胞内酪氨酸激酶结构域功能。狐狸KIT基因17号外显子缺失导致酪氨酸激酶域结构和功能发生改变，赤狐被毛表现为铂金色[24]。蓝狐KIT基因12号外显子缺失导致酪氨酸激酶活性发生改变，被毛表现为白色[5]。而在乌苏里貉KIT基因中并未发现与毛色相关的单核苷酸位点[10]，Frischknecht报道全长7 125 bp的FERV1插入KIT基因内含子1中，导致猫产生白色斑点[25]。目前，对于各物种KIT基因结构研究较少，乌苏里貉KIT蛋白研究结果可为进一步比较分析提供参考。乌苏里貉KIT基因转录及翻译调控研究仍较少，是否存在miRNA调控仍未知，由于抗体有限，测定不同毛色乌苏里貉KIT蛋白表达量仍有难度。推测乌苏里貉毛色也可能受KIT基因非编码区调控，或是通过一种负反馈调节黑色素形成。