黑龙江水系6个地理群体银鲫染色体倍性和肌肉营养分析

韩 英，李洪卿，薛淑群，吕晓楠，马 凯

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.北京市水产技术推广总站，北京 100176）

鲫（Carassius auratus）属于鲤科（Cyprinidae）、鲫属（Carassius），为亚欧大陆常见淡水鱼类，具有高蛋白、低脂肪、味道鲜美等特点。鲫养殖成本低、效益好，是我国重要淡水养殖鱼类，但与其他鲤科养殖鱼类相比生长速度较慢，培育生长速度快且肉质好的品种为目前主要育种目标。银鲫（Carassius auratus gibelio）为鲫的亚种，广泛分布于黑龙江水系和新疆额尔齐斯河，黑龙江水系所产鲫亦均为银鲫。与鲫相比，银鲫具有背高、个体大、生长速度快等特点，且银鲫肉质细嫩、味道鲜美，深受消费者喜爱，养殖前景广阔[1]。

黑龙江水系复杂，流域宽广，银鲫资源丰富。由于地理环境和水文环境差异，银鲫在黑龙江水系形成较多地理群体。这些地理群体在生物学性状上无显著差别，但在染色体倍性上有二倍体和三倍体之分，三倍体银鲫行雌核发育，生长速度更快。不同地理群体肉质风味不同，其中方正银鲫、红肚鲫、亮珠河鲫和镜泊湖鲫等，为具有优良性状的名优地理群体。方正银鲫原产于黑龙江省方正县双凤水库，较鲫生长速度快20%以上，具有背厚、出肉率高、耐寒冷、抗病力强、个体大、经济价值高等特点，也是我国鱼类育种和养殖开发重要对象，异育银鲫即以方正银鲫为母本，经兴国红鲤异精刺激雌核发育而成。红肚鲫产自乌苏里江一级支流挠力河，鳞片呈金黄色，腹部橘黄，出水后腹部逐渐变红，肉质鲜美，体色靓丽，具有较高育种价值[2]。亮珠河鲫产自松花江二级支流亮珠河，具有头小、个体大、生长快等特点，已在局部地区开展养殖，并获得良好养殖收益。镜泊湖鲫产自松花江水系镜泊湖，具有头小、背厚、个体大等特点，在唐朝曾为贡品，为黑龙江稀有名优银鲫[3]。

目前，黑龙江水系银鲫研究主要集中于方正银鲫，包括其生长性状、肌肉营养成分、染色体倍性等[4-6]。目前尚未系统研究和开发利用黑龙江银鲫更多地理群体，其肉质、生长速度和个体尺寸方面表现良好，为重要育种材料和养殖对象。本研究以黑龙江水系红肚鲫、挠力河鲫、宝清鲫、方正鲫、亮珠河鲫和镜泊湖鲫共6个地理群体银鲫为研究对象，采用流式细胞术检测其染色体倍性，采用生化分析方法测定分析和评价其肌肉营养，以期为名优地理群体开发和养殖新品种选育奠定基础。

1 材料方法

1.1 试验动物及样品制备

所有银鲫采集于2017年9～11月，6个地理群体共108尾。其中红肚鲫（HD）16尾采自乌苏里江一级支流挠力河中游，体重为（173.27±32.16）g；挠力河鲫（NL）16尾采自挠力河上游，体重为（218.60±29.16）g；宝清鲫（BQ）19尾采自挠力河水系宝清县黑泡水库，体重为（140.78±38.39）g；方正银鲫（FZ）16尾采自方正县方正银鲫原良种场，体重为（175.25±46.75）g；亮珠河鲫（LZ）20尾采自松花江二级支流亮珠河，体重为（312.52±100.14）g；镜泊湖鲫（JP）21尾采自牡丹江水系镜泊湖，体重为（405.87±180.15）g。实验用鱼在东北农业大学动物科学技术学院养鱼室暂养，并作倍性检测。

30 mg·L-1丁香酚（购自上海铭睿生物科技有限公司）溶液将试验鱼麻醉后处死，每个地理群体随机选择5尾鱼，取相同重量侧线以上背部去皮无骨肌肉，剪碎、均匀混合作为一个样本。每个地理群体制备3个样本，每个样本平均分成2份，一份用于肌肉营养成分检测，一份用于氨基酸含量测定，-20℃保存待测。

1.2 染色体倍性检测

参考Kendall等[7]方法，采用流式细胞术检测染色体倍性。标准样品为鸡血，每个地理群体取3尾鱼，用30 mg·L-1丁香酚溶液将试验鱼麻醉后取血液加入至生理盐水（1∶3）中混匀，后缓慢滴加于6 mL人体淋巴细胞分离液液面上，于20℃、2 500 r·min-1离心20 min。弃上清，加6 mL生理盐水，20 ℃、600 r·min-1离心20 min，重复3次，最后用1 mL生理盐水重悬。取单细胞悬液100 μL，加入6 mL预冷卡诺固定液（甲醇∶无水乙醇=3∶1），混匀后于4℃冰箱固定2 h。固定后在4℃、800 r·min-1离心5 min，弃上清，加入6 mL生理盐水，混合均匀后，4℃、600 r·min-1离心3 min，弃上清重复3次。加生理盐水至1 mL，在4℃、避光条件下PI染色30 min。过400目筛，使用流式细胞仪检测。

流式细胞仪为美国BD公司FZCSARIA型，人体淋巴细胞分离液、PI染色剂购自广州博越生物科技有限公司。

1.3 肌肉营养成分测定

1.3.1 水分、粗灰分、粗脂肪测定

按照GB/T5009-2016中直接干燥法、高温灰化法和索氏提取法测定水分、粗灰分和粗脂肪，每个检测3个重复。

1.3.2 粗蛋白测定

参照GB/T5009.5-2016中凯氏定氮法，根据仪器实际要求测定粗蛋白。首先对盐酸标准溶液标定，计算标准溶液浓度为c。空白测定，所用盐酸标准溶液体积记为V0。取0.2 g干燥样品（记为W）于消化管，加入硫酸铜0.2 g、硫酸钠3 g、浓硫酸10 mL，混合均匀后于消煮炉上300℃加热至无泡沫，升温至410℃后加热至溶液澄清。冷却至室温后，加双蒸水至100 mL，样品分解液体积记为V。取10 mL消解液加入2%硼酸溶液20 mL、混合指示剂2滴，蒸馏（体积记为V'）。使用已标定盐酸标准溶液滴定，滴定终点为灰红色，记样品标定所用体积为V1。

粗蛋白含量计算公式如下:

式中，系数6.25为氮-蛋白质换算系数，0.0140为每mL盐酸标准溶液相当于氮g数。粗蛋白测定作3个重复。

1.4 氨基酸含量检测方法

参照GB/T5009.124-2016，根据试验仪器要求，对混合均匀的肌肉样品脱脂处理（索氏提取法），粉碎过80目筛，准确称取100 mg样品移入15 mL水解管，加8 mL 1∶1 HCl，充氮气封口，于110℃烘箱内水解24 h。冷却后摇匀过滤（0.45 μm过滤器），超纯水定容至50 mL，取1 mL样品液于5 mL离心管，真空冻干机冻干。冻干后加1 mL 0.02 mol·L-1HCl震荡摇匀，吸上清0.8 mL过0.45 μm过滤器后上机检测。氨基酸含量检测作3个重复。

氨基酸自动检测仪为日本HITACHI厂L-8800型，检测时进样量为0.8 mL，分离柱柱温为57℃，反应温度为135℃，分离缓冲液流速为0.40 mL·min-1，茚三酮反应液流速为0.35 mL·min-1，波长为440 nm。

1.5 肌肉营养品质评定方法

鱼肉营养品质评价根据联合国粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）1973年建议的氨基酸评分模式（AAS）[8]和全鸡蛋蛋白质氨基酸模式（CS），分别计算6个地理群体银鲫肌肉氨基酸AAS值、CS值、必需氨基酸指数（EAAI）。计算F值，F值为支链氨基酸和芳香族氨基酸比值。公式如下:

1.6 统计分析

采用Excel 2016软件统计和计算试验数据，使用SPSS 21.0软件作单因素方差分析和多重比较，具有方差齐性的变量采用LSD法，不具有方差齐性的变量采用Tamhane's T2法。数据表示方法为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 染色体倍性

染色体倍性检测结果见图1。以鸡为标准二倍体，标品鸡血红细胞DNA含量为50×1 000，6个地理群体银鲫红细胞DNA含量均为75×1 000，由此确定6个地理群体银鲫均为三倍体。

2.2 肌肉营养成分

6个地理群体银鲫肌肉营养成分见表1，结果显示其营养成分含量不同。水分平均含量为79.53%，各群体间差异不显著。粗灰分平均含量为2.61%，最高为BQ，依次为FZ、NL、LZ、HD，JP为最低，除LZ与HD外，各群体间差异显著（P＜0.05）。粗脂肪平均含量为1.41%，最高为FZ，依次为JP、NL、BQ、HD，最低为LZ，其中FZ和JP显著高于其他地理群体，JP与NL显著高于HD和LZ。粗蛋白平均含量为17.12%，最高为JP，依次为FZ、NL、LZ、HD，BQ为最低，其中JP和FZ显著高于其他地理群体，NL显著高于HD和BQ。

2.3 氨基酸组成及含量

氨基酸测定结果如表2所示。

表1 6个地理群体银鲫肌肉营养成分（%，湿重）Table 1 Nutritional component contents in fresh muscle of six populations C.auratus gibelio（%，wet weight）

表2 6个地理群体银鲫氨基酸组成及含量（%，湿重）Table 2 Content and proportion of amino acid in fresh muscle of six populations C.auratus gibelio（%，wet weight）

6个地理群体银鲫肌肉中共检测出17种常见氨基酸（样品经过酸处理，导致色氨酸被破坏而无法检出），其中包括人体中必需氨基酸7种（Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys），半必需氨基酸 2种（His、Arg），非必需氨基酸 8种（Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Tyr、Pro）。

6个地理群体银鲫氨基酸总量（TAA）为14.66±0.70%，最高为FZ，依次为BQ、JP、LZ、HD，NL为最低，其中FZ显著高于其他地理群体，BQ显著高于除FZ外其他4个地理群体，JP、LZ和HD显著高于NL。BQ群体中含量最高的3种氨基酸依次为谷氨酸（1.72±0.05%）、甘氨酸（1.71±0.03%）和亮氨酸（1.60±0.01%），其他5个群体中含量最高的3种氨基酸依次为甘氨酸（1.82±0.14%）、谷氨酸（1.66±0.08%）和亮氨酸（1.48±0.07%）。6个地理群体氨基酸含量最低均为胱氨酸（0.036±0.00%）、组氨酸（0.313±0.02%）和脯氨酸（0.452±0.06%）。

6个地理群体银鲫必需氨基酸总量（EAA）为5.68±0.28%，FZ为最高，依次为BQ、JP、HD、LZ，NL为最低，其中FZ和BQ显著高于其他群体，JP与HD显著高于NL。6个群体含量最高的必需氨基酸均为亮氨酸，含量为1.48±0.08%；最低均为蛋氨酸，含量为0.31±0.02%。必需氨基酸与总氨基酸比值（WEAA/WTAA）平均为38.73%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量比值（WEAA/WNEAA）平均为72.24%。F值为2.16～2.40。

6个地理群体银鲫检测到4种鲜味氨基酸，总量为6.24±0.33%，以FZ最高，依次为BQ、LZ、JP、HD，NL为最低，其中FZ显著高于其他群体，BQ显著高于HD和NL。FZ天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量显著高于其他群体（P＜0.05），而NL中谷氨酸和丙氨酸含量显著低于其他群体（P＜0.05）。6个群体银鲫肌肉中鲜味氨基酸含量最高均为甘氨酸，含量最低均为天冬氨酸。

2.4 肌肉必需氨基酸组成评价

计算每个地理群体银鲫肌肉中各必需氨基酸AAS、CS值，见表3。结果可见，BQ中AAS和CS最高为亮氨酸，其他5个群体最高为苏氨酸。以AAS值和CS值为评价指标，6个地理群体银鲫第一限制氨基酸皆为蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸皆为缬氨酸。除第一、第二限制氨基酸，其他必需氨基酸AAS分值均接近或大于1，CS分值均接近或大于0.7。NL与JP群体EAAI大于65，其余4个群体均大于70。

表3 6个地理群体银鲫肌肉中必需氨基酸组成评价Table 3 Evaluation on the composition of essential amino acid in six populations C.auratus gibelio

3 讨论

3.1 6个银鲫地理群体染色体倍性

研究指出，黑龙江水系中鲫具有天然二倍体和天然三倍体之分，而不同倍性鲫的地理分布具有一定区域性，黑龙江省东部、镜泊湖等区域主要为三倍体种群分布区，松花江、牡丹江下游区域则为二、三倍体种群混栖分布区。河流型水域多为二、三倍体种群混栖区而湖泊、水库类型则多为三倍体种群分布区[9]。本研究中HD、NL、BQ群体位于黑龙江省东部乌苏里江水系，FZ、LZ、JP群体位于牡丹江水系。结果显示这6个地理群体银鲫均为三倍体，与上述研究结果相符。三倍体银鲫行雌核发育，可快速建立纯系，加快品种、种群等选育系形成，提高选种效率，将优良性状稳定遗传[10]。因此，6个地理群体具有较高养殖和育种价值。

3.2 6个银鲫地理群体的营养价值

在肌肉营养成分中，粗蛋白和粗脂肪含量为营养价值评价重要指标。由表1可知，6个地理群体银鲫肌肉中粗蛋白平均含量为17.12%，高于鳜[11]、草鱼[11]、鳙[12]，低于虹鳟[13]、花鳗鲡[14]。粗脂肪平均含量为1.41%，高于鳜[11]、草鱼[11]、鳙[12]，低于虹鳟[13]、鲤[15]。不同食性鱼类粗蛋白含量不同，一般肉食性鱼类相对含量较高，如鳜。而银鲫为杂食性鱼类，其粗蛋白水平却高于鳜，说明这6个地理群体银鲫粗蛋白含量极为丰富。不同生活习性和饲养方式对于肌肉脂肪含量有显著影响[16]。本研究中银鲫粗脂肪含量属于较低水平，是理想保健食品。6个地理群体银鲫水分平均含量为79.53%，粗灰分平均含量为2.61%，与彭泽鲫[17]、松浦鲫[18]等研究结果相似。6个地理群体相比较，JP粗蛋白含量最高，粗脂肪含量位居第二，营养价值最高。

从食品营养学角度看，食品蛋白质营养价值在很大程度上取决于其必需氨基酸含量及比例。由表2可知，6个地理群体银鲫EAA含量平均为5.68±0.28%，高于草鱼[11]、鳙[12]，低于虹鳟[13]、异育银鲫[19]，属于较高水平。FAO/WHO理想蛋白质模式认为，质量优良的蛋白质其氨基酸组成WEAA/WTAA在40%左右，WEAA/WNEAA在60%以上[20]。本研究中6个地理群体银鲫WEAA/WTAA均接近40%，WEAA/WNEAA均大于70%，说明这6个地理群体银鲫是符合人体需求的优秀蛋白质来源。综合EAA含量和WEAA/WTAA、WEAA/WNEAA比值来看，未开发群体中BQ和JP氨基酸营养价值更高。

通过必需氨基酸组成评价可知，蛋氨酸+胱氨酸和缬氨酸分别为第一、第二限制氨基酸，因此，人工饲养或食品加工时应注意添加这两种必需氨基酸，进一步提高其鱼肉品质。AAS、CS和EAAI指标反映这6个地理群体银鲫必需氨基酸含量丰富，且组成相对均衡，具有较高营养价值。

3.3 6个银鲫地理群体氨基酸组成

由表2可见，6个地理群体银鲫蛋白质中氨基酸种类齐全，含量较高，其TAA含量为14.66±0.70%，高于欧洲鳗鲡[14]、俄罗斯鲟[21]，接近鳜[11]，低于虹鳟[13]。HD、NL、FZ、LZ和JP 5个地理群体中甘氨酸含量最高，其次为谷氨酸；BQ群体谷氨酸含量最高，其次为甘氨酸。甘氨酸为中枢神经中必需氨基酸，作为一种神经递质对大脑神经活动有刺激和抑制作用，并可刺激胰高血糖素分泌。谷氨酸在生命体蛋白质代谢过程中起重要作用，影响大脑发育，也是脑中各种生物化学反应和多种生理活动所需关键氨基酸[22]。因此，经常食用银鲫利于血糖调节，同时对大脑发育有一定积极作用。亮氨酸为8种人体必需氨基酸之一，可调节蛋白质代谢、修复肌肉、降低脂肪合成并促进脂肪分解，为本研究中含量最高必需氨基酸，高于FAO/WHO标准蛋白模式，接近或高于鸡蛋蛋白模式。因此，银鲫作为食物有益机体健康，是理想保健食品。赖氨酸为8种人体必需氨基酸之一，对人体生长发育、机体免疫力和抗病毒有积极作用，也是一般谷类和人乳蛋白质第一限制氨基酸[23]，本研究中6个地理群体银鲫肌肉中赖氨酸含量较高，均高于FAO/WHO标准蛋白模式。因此，银鲫作为食品可补充其他食材的赖氨酸不足，对人体具有特殊营养价值和保健作用。

鱼肉鲜美程度主要取决于肌肉中鲜味氨基酸组成及含量。6个地理群体银鲫肌肉中共检测出4种鲜味氨基酸，总量高于草鱼[11]和鳙[12]。甘氨酸为呈甘味特征氨基酸，为动物营养最重要且最简单的非必需氨基酸，对改善动物和人体健康有利。谷氨酸为呈鲜味特征氨基酸，作为氮代谢基本氨基酸之一，对动物大脑发育有重要意义。本研究中，甘氨酸和谷氨酸为17种氨基酸中含量最高的两种氨基酸，说明6个地理群体银鲫肉味鲜美。

综上所述，从肌肉营养成分看，黑龙江水系银鲫6个地理群体均具有高蛋白、低脂肪的特点。氨基酸组成相对均衡，氨基酸总量、必需氨基酸总量及鲜味氨基酸含量高，是营养价值较高的优质鱼类，也是理想的保健食品。其中，已开发的方正银鲫肉质良好，氨基酸营养最佳；未开发地理群体中镜泊湖鲫综合表现最佳，具有较高的开发利用价值。