抗犬真菌性皮肤病中药的筛选

李秀宇，李春花，柴方红

1.吉林农业科技学院，吉林吉林市 132109；2.吉林省牧业信息中心，吉林长春 130062

犬皮肤真菌病是宠物门诊的常见性、多发性、人畜共患皮肤病，是由犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及马拉色菌等致病性真菌黏附于犬皮肤上，侵入皮肤表皮、毛发或趾甲从而引起皮肤的一系列器质性病变，是犬临床最常见的传染性皮肤疾病之一[1]。其临床特征是掉屑、脓包、红的斑点、掉毛及丘疹等，继发感染可能出现疡、糜烂。犬皮肤真菌病的顽固性强、难治愈、病期长、易反复，并可通过动物传染给人，对动物和人类的健康造成严重影响。临床治疗更多选择用抗真菌西药，而西药价格更贵，且具有更明显耐药性。由于近几年耐药菌株增多和皮肤病复发率增高，这让兽医研究者更加努力研究新型抗真菌药物。

中药是中华几千年留下的精华资源，对于真菌病的防治，具有天然性、毒副作用小、不易产生抗药性等优势，效果不比西药差，蕴含着巨大的创新潜能。此试验选取多种中草药，如黄芩、黄连和苦参具有泻实火，除湿热等作用[2]，白鲜皮具有清热燥湿、祛风止痒、解毒功效，主治风热湿毒所致的风疹、湿疹、疥癣、湿热痹[3]。通过对临床皮肤真菌病患犬分离菌株，并比较不同药物的杀菌效果，进行了合理组方，并且进一步研究了组方的有效性，希望开发出一种价格低廉、更高药效、抗菌谱广的新型抗真菌药物，为临床抗真菌药物的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

吉林市昌邑区某犬舍真菌性皮肤病的患犬。

1.1.2 药品试剂

射干、金银花、冰片等中药购于吉林市昌邑区百草堂中药店。

盐酸特比萘芬、青霉素沙氏葡萄糖琼脂培养基和葡萄糖蛋白胨培养基等由吉林农业科技学院微生物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 诊断方法

1.2.1.1 临床诊断

患犬的患病部位出现圆形脱毛的秃癍、掉屑、瘙痒和结痂。

1.2.1.2 伍氏灯检查

需先把灯预热5～10 min，再用灯在暗室里照射病患部位的毛、皮屑或皮肤缺损区，观察有蓝绿色荧光，初步判断有真菌感染。

1.2.1.3 实验室诊断

在皮肤的健康与患病交界处采集毛、鳞屑或痂块放在载玻片上，加1 滴10%氢氧化钾溶液盖上盖玻片，放置30 min 后在显微镜下检查，发现有大量真菌菌丝。

1.2.2 病料采集与接种培养

1.2.2.1 病料采集

在患犬患病部位消毒、剃毛后，持刀片垂直刮取病料，装入灭菌青霉素瓶中。

1.2.2.2 接种培养

以沙氏葡萄糖蛋白胨培养基(SDA)为基础培养基，进行真菌分离培养[4]。在平皿上记录编号、部位、日期；每隔1d 观察1次，按照菌落生长情况（快、慢、菌落特点等）判定是显微镜观察还是停止培养。在沙氏葡萄糖琼脂培养基上，分离培养3～4 周。

1.2.3 致病真菌鉴定

在SDA 培养期间，每天对真菌生长形态进行观察，进行初步鉴定。然后进一步培养可疑真菌，培养基为含有酚红pH 显示剂葡萄糖蛋白胨培养基（DTM），为兽医学临床上最适宜的真菌培养基。在DTM 中连续培养3～4 周，期间每天进行观察，且从第3～28 天进行显微镜观察，根据菌落形态和显微结构特点进行真菌鉴定[5]。

通过致病真菌的菌落生长特征和显微结构的观察，发现有4 种致病真菌，并分别命名为菌1，菌2，菌3，菌4。这4 种致病真菌的菌落特征观察结果见表1。

表1 SDA 培养基上四种致病真菌的菌落特征

根据菌落形态特点和显微结构的观察结果，可以确定菌1 为犬小孢子菌，菌2 为石膏样小孢子菌，菌3 为絮状表皮癣菌，菌4 为马拉色菌。

1.2.4 菌种保存

采用沙氏低糖蛋白胨琼脂培养基，以大试管制备斜面培养基。在超净工作台，用接菌环将分离的病原真菌传代至已制备好的斜面上，在适宜的生长环境下继续培养。保存在-4 ℃冰箱中，然后用棉塞和纸套覆于菌种管口，以防止管内潮湿或管内水份蒸发过快。

1.2.5 中药的筛选

1.2.5.1 中药提取将射干、金银花、冰片等每种单味中药生药50g 加水200mL，浸泡30 min，文火加热煮沸1 h。药汁用纱布过滤后得提取物，滤渣重复上述步骤2次后合并滤液，弃去滤渣[6]。再将合并的滤液文火加热浓缩至50mL，得到浓缩液1g/mL。

1.2.5.2 中药体外抑菌试验

①菌液制备：按照SDA 培养基制作说明制备，在其中心接种病原真菌，28 ℃活化培养1 周，活化2次，使菌落覆盖SDA 琼脂平板[7]。用血细胞计数板，将菌液浓度调整为5～6×104个/mL，备用。

②药基制备：制备SDA 培养基，每个试管加入1.5mL，并分别加1.5mL 各种单味中药药液于每个斜面培养基，浓度是1g/mL 的生药水；设阳性对照组4 支试管，分别加入浓度为25 mg/mL 的特比萘芬1.5mL，终浓度为12.5 mg/mL；设阴性对照组4 支试管，分别加入生理盐水1.5mL[8]。115℃高压灭菌15 min，放置于斜面并待其冷却后使用。③接种：吸取已经制备好的菌液5 µL，将其接种于药基的表面，将菌液均匀涂布，放置于恒温箱中，28 ℃培养2 周，观察真菌的生长状况。根据其生长发育状况，用“+”或“-”表示中药对病原真菌生长抑制作用的“有”或“无”。

1.2.5.3 确定组方

根据单味中药抑菌试验的结果和中医辩证理论，确定三组中药组方进行试验，如下。

复方中药组一：冰片、白矾、白鲜皮、五倍子、苦参。

复方中药组二：荆芥、金银花、百部、五倍子、防风。

复方中药组三：皂角、石榴皮、地肤子、白鲜皮、黄连。

1.2.5.4 中药组方抑菌试验

①菌液制备：同中药体外抗真菌试验菌液的制备。

②药基制备：参照单味中药的平板抑菌试验结果，按照辨证施治的原理，最终确定3个中药组方，分别命名为组方1、2、3[9]。各组方中有5 味中药，药物配比后称取50g，提取得到中药水浓度为1g/mL；针对病原真菌，每个组方作4个浓度梯度，共准备12 支试管，再加上阳性对照1 支，阴性对照1 支，分别编号。每支试管中加2.25mLSDA 培养基，再加药液0.25mL 于培养基试管内，将药物浓度依次稀释成100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL。115℃高压灭菌15 min，放置于斜面并待冷却后使用。为了避免试验误差，需要进行4组重复试验。

③接种：吸取5mL 菌液，接种在药基表面，均匀涂布，置28 ℃恒温箱中培养每日观察试验结果[10]。

④结果观察：根据真菌的生长发育状况，中药的抑菌作用表现为“-”、“+”、“++”、“+++”4个水平。4 株真菌分别培养2 周后，观察判定其终点。

2 体外抑菌试验结果

2.1 单味中药体外抑菌结果

除17 味中药外，另设阳性对照和阴性对照，对马拉色菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌和石膏状小孢子菌4 种病原真菌分别进行药敏试验，结果如表2 所示。

表2 17味中药提取物对致病性真菌的抑制作用

2.2 中药组方体外抑菌结果

所选3 种中药组方采用体外抑菌试验，判断其对致病性真菌的抑菌活性，同时根据结果选出最佳组方，结果如表3 所示。

试验结果表明，3个中药组方对各致病菌都有抑制作用，由表3 可知组方一对4 种致病性真菌的抑菌效果均高于其他组方。因此根据数据统计分析，综合各种因素确定组方一为最佳的中药组方，即冰片、白矾、白鲜皮、五倍子、苦参所组成的方剂。

表3 中药组方对致病性真菌的抑制作用

3 分析与讨论

本试验所选17 味中草药，皆是文献记载有抑菌作用的药物，其中一些已多次在皮肤真菌病成方中出现。据张悦天等人报道，射干、五倍子粗粉在超声提取的最佳工艺下，其提取物浸膏对4 株真菌的抑菌效果明显。据禹泽中、朱云安报道，荆芥、防风、白鲜皮等中药组成的中药组方对犬真菌性皮肤病的治愈率高于伊维菌素等西药组。

根据一定的体外抗真菌方法，筛选出具有明显抗真菌作用的中药，尽管不同中药对真菌抑制作用有特异性，且相同中药对各种真菌的抑制作用也有不一致。但以筛选抗真菌中药为前提，还是完成了预期的目标。

盐酸特比萘芬属于外用药，涂抹在患部后，动物舔食后也许会出现中毒症状，如恶心、厌食、轻度腹痛和腹泻等，或轻度皮肤反应(皮疹、荨麻疹）等。因此，中药在治疗过程中不仅能保证疗效，还能确保安全性。

最佳复方中药包含冰片、白矾、白鲜皮、五倍子、苦参共5 味中药，几味药组合，有清热燥湿、祛风止痒、解毒消肿、燥湿敛疮之功效，主治风热湿毒所致的风疹、皮肤瘙痒、疥癣湿疮、痈疽肿毒。既符合中医理论，又适合制成外用制剂，而该组方的临床应用效果如何，其作用机理是什么，还有待进一步研究。