荧光探针8-萘重氮氨基-2-硫代苯并噻唑的合成及性质研究

刘雯静，钟榕榕，翁文婷，谢晓兰

(泉州师范学院化工与材料学院,福建 泉州 362000)

荧光分析法作为一种操作简便、高灵敏度的光谱分析方法，在生物化学、医学和化工领域广泛应用。发展新型荧光试剂探针是发展荧光分析的重要途径，也是研究荧光体系的内在规律的基础[1]。通常能发荧光的荧光体多为有机芳香族化合物[2]。具有自发荧光的有机化合物因其荧光谱带宽阔、易相互重叠而不易识别。合适新型荧光试剂对于提高待测物质检测检出限和灵敏度有很大帮助，因而开发一种灵敏、专一性、高效的荧光探针具有很重要的意义。

萘胺是一种很好的荧光基团，其结构中的芳伯氨基有利于发生重氮化，有利于偶合加成反应。Sun课题组[3]通过将萘胺和罗丹明合成制备比率型的荧光探针，实现了对钯离子的灵敏检测。Ghosh等[4]合成多种萘胺衍生物作为Fe(Ⅲ)的高灵敏检测的新型荧光探针。同时，其课题组[5]制备的萘胺衍生结构荧光探针，可以实现水介质中的Hg(Ⅱ)，Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的同时检测，有效应用在活细胞和生物逻辑门的研究中。2-巯基苯并噻唑是一种化工中间体，具有较强的吸电子或给电子能力，但是其杂环结构较简单，荧光性能不明显。王金金等[6]以苯并噻唑为荧光团结合氰基乙酸乙酯合成了能够双重检测水合肼和亚硫酸盐的荧光探针。古雯蕾等[7]将2-肼基苯并噻唑与2-氰基苯甲醛缩合，得到一种在水体系中能高选择性、高灵敏度地识别Ag+的席夫碱型荧光化合物。

若能在苯胺结构中引入苯并噻唑基团后形成重氮化结构的荧光试剂，可形成较大的刚性平面结构从而提高荧光性能。形成的重氮氨基类试剂又具有很好的配位基团，是金属离子的优良显色剂，该类试剂可具有高灵敏度和选择性的特性[8-10]。

本文以1-萘胺和2-巯基苯并噻唑为原料，合成一种新型偶氮型荧光试剂8-萘重氮氨基-2-硫代苯并噻唑(NADTBT)。采用高效液相色谱法、红外光谱法及质谱法对其结构进行表征，并用荧光光谱法测定其荧光特性，讨论其和金属离子的作用机理。发现其和多种金属离子均有作用导致荧光强度发生变化，对铜离子响应最为灵敏。在(1.00～9.00)×10-6mol/L范围内，铜离子浓度与荧光猝灭程度呈现良好的线性关系，线性回归方程为F0/F=1.517 1×106CCu2++1.891 8，相关系数r=0.995 5。因此，合成的NADTBT可作为一种全新的铜离子检测的荧光分析探针。

1 实验部分

1.1 原料与仪器

2-巯基苯并噻唑(C7H5NS2, MBT)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；1-萘胺(C10H9N, NA)分析纯，上海试剂三厂；其他试剂均为国产分析纯，使用水为二次蒸馏水。

AVAT-360傅里叶红外光谱仪，美国尼高利有限公司；Cary/Eclipse荧光光度计，东南化学仪器有限公司；Agilent 1100LC高效液相色谱仪，美国Agilent有限公司：色谱柱Zorbax eclipse XDB C18柱( 150 mm×4.6 mm)；Agilent-5973N气相色谱/质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；XMTD-822真空干燥箱，厦门市宝能科技有限公司。

1.2 新型荧光试剂的合成

准确称取0.213 3 g 1-萘胺溶解于1.0 mL甲酸、3.0 mL水和1.0 mL盐酸的混合溶剂中，在0～5 ℃冰浴中，边搅拌边缓慢加入2.0 mL浓度为1mol/L的亚硝酸钠水溶液，反应30 min为A溶液，使其重氮化完全。另外称取0.1671 g的2-巯基苯并噻唑溶于20 mL乙醇中为B溶液。在0～5 ℃条件下，将B溶液边搅拌边加入A溶液。并用饱和碳酸钠溶液调节混合液的pH值为7～8，恒温反应2 h后，放入冰箱中静置过夜，析出晶体。减压抽滤，先后用水和乙醇多次洗涤，并放入真空干燥箱中40 ℃烘干。干燥后的粗产品用体积分数为95%的乙醇重结晶2次得纯品, 并计算产率[11]。合成路线如图1所示。

图1 NADTBT的合成路线

1.3 荧光光谱测定

准确称取NADTBT固体粉末，配制不同溶剂和不同pH值的1.0×10-4mol/L NADTBT-乙醇溶液，在荧光光谱仪上进行荧光光谱扫描，在狭缝比为5.0 nm/5.0 nm，λex=225 nm处进行荧光光谱的测定，光电倍增管电压为400 V，扫描速度为1 200 nm/min的条件进行测定。讨论不同溶剂及pH值溶液环境对NADTBT荧光性能的影响。

准确移取1 mL 5.0×10-5mol/L NADTBT溶液，加入的不同量的金属离子和5 mL pH=6.86的混合磷酸盐缓冲溶液，以水定容至10 mL，混匀后进行荧光光谱的扫描。考察金属离子加入前后对NADTBT溶液的荧光光谱强度变化。

采用相对法对NADTBT的PLQY进行计算，以硫酸喹啉的0.1 mol/L的硫酸溶液(Ys=0.54)作为参比物质。采用以下计算公式进行计算[12]：

式中：Au、As—为待测物质和参比物质在该激发波长的入射光的吸光度；Fu、Fs—为待测物质和参比物质的积分荧光强度；Yu、Ys—待测物质和参比标准物质的荧光量子产率。

为避免溶液的自吸收效应，应保证溶液的紫外吸光度值应低于0.05。

2 结果与讨论

2.1 合成反应条件的优化

称取摩尔比约为1∶2的2-巯基苯并噻唑和1-萘胺，在其他反应条件相同的情况下，考察反应时间为对产量的影响。实验结果表明，随着反应时间的增加，产物的产率逐渐增大。当反应时间延长至2 h以上，合成产率变化不大，为了提高效率，选择其最佳反应时间为2 h。

称取摩尔配比为1∶1、2∶3、1∶2、1∶3的2-巯基苯并噻唑和1-萘胺共4组，在其他反应条件相同的情况下，考察不同反应物配比对产量的影响。实验数据表示，2-巯基苯并噻唑的配比过高或者过低都会使产率降低，当摩尔比为2∶3时，产率达到最高。

2.2 NADTBT的组成及物理性质

按最优化条件制备NADTBT，提纯后产物呈现红褐色粉末状固体；产率为40.7%；产物在室温下易吸潮；不溶于碱，微溶于水和酸，可溶于乙醇。

2.3 结构表征

2.3.1 红外光谱

取烘干处理后的1-萘胺、2-巯基苯并噻唑和NADTBT固体粉末，制备KBr压片，于红外谱仪上测定化合物在400～4 000 cm-1处的红外光谱图。

如图2所示，由NADTBT谱图可知在波数为3 429 cm-1处有一明显的N—H吸收峰，不同于两种反应物，而且氨基峰比萘胺的加宽很多，这可能是由形成环状—NH—基团造成；1 559，1 468，1 428 cm-1处有苯环骨架吸收峰；1 622 cm-1处为—N=N—吸收峰；1 005 cm-1处为Ar-N吸收峰，进一步验证合成产物的结构。

图2 1-萘胺、2-巯基苯并噻唑和NADTBT的红外光谱

2.3.2 质谱表征

配制1.0×10-5mol/L NADTBT-乙醇溶液，通过气相色谱质谱联用仪进行质谱的测定。其质谱图分别出现m/z143、115、89、71、58等多个离子峰。其中m/z143可能是萘胺在电子轰击质谱得到样品分子瞬间高温高度碎裂后的分子离子碎片，推断可能裂解结构如图3所示，这符合质谱的氮律规则。m/z115也具有较大质量数，这可能是因为MBT分子中的苯环连接有2个杂原子N和S，不能有效的离子化，而导致五元环开裂，失去两个电子形成的二价离子碎片，同类的重氮萘胺的二价离子碎片刚好符合m/z71，形成这类的二价离子是杂环、芳环及高度不饱和化合物的特征。

图3 NADTBT的分子结构的可能裂解过程

2.3.3 高效液相色谱表征

配制10 μmol/L的2-巯基苯并噻唑溶液、1-萘胺和NADTBT乙醇溶液，分别进行高效液相色谱仪扫描。由图4可知，在相同流速和进样量的条件下，测得NADTBT保留时间为7.655 min，明显不同于原料2-巯基苯并噻唑和1-萘胺的保留时间为9.695 min和2.135 min。由此可以定性说明所制备的NADTBT为一不同于原料的全新化学物质。

图4 2-巯基苯并噻唑、1-萘胺和NADTBT的高效液相色谱

2.3.4 荧光光谱表征

按实验方法测试1-萘胺、2-巯基苯并噻唑和NADTBT的荧光光谱，实验结果如图5所示。NADTBT在225 nm激发波长下于366 nm处有一明显荧光峰；而相同条件下2-巯基苯并噻唑结构并未有明显荧光信号，1-萘胺的荧光发射峰在428 nm处，峰型特征明显区别于产物。由此推测，制得的NADTBT是通过N=N基团连接一个萘环和一个巯基苯并噻唑环，形成一个大π-π*共轭体系，具有不同于萘环的荧光特性，为一种新荧光物质。采用相对硫酸喹啉荧光法对NADTBT的PLQY进行计算，测得相对荧光量子产率为5.82%。

图5 NADTBT溶液与反应物的荧光光谱对比图

2.4 荧光强度影响因素的探讨

2.4.1 溶剂对NADTBT溶液的影响

按实验方法配制不同溶剂的NADTBT溶液，于荧光分光光度计上测绘荧光光谱。结果如图6所示。

图6 (a)不同溶剂的NADTBT溶液的荧光光谱和(b)荧光强度变化趋势

NADTBT的乙醇溶液的荧光强度最高，在其他溶剂环境中NADTBT的发光性能较弱。所以最终选择乙醇为体系研究的最佳溶剂。

2.4.2 pH值的影响

按实验方法，考察乙醇溶液pH值对NADTBT荧光性能的影响。实验结果如图7所示，NADTBT的荧光强度随着pH值的增大而逐渐增强，但当pH=13时，荧光强度不增反而急剧下降。这可能是因为强碱性条件下NADTBT 的N=N结构发生水解导致的。

图7 不同pH值环境中NADTBT的(a)荧光光谱和(b)荧光强度变化趋势图

3 荧光探针NADTBT的应用研究

3.1 NADTBT对不同金属离子的响应

在以上确定的最佳实验条件下，按实验方法加入不同浓度的过渡金属离子，考察加入金属离子前后NADTBT的荧光光谱变化，结果如图8所示。

图8 不同浓度金属离子对NADTBT试液的荧光强度猝灭趋势

在一定的浓度范围内，对NADTBT的荧光猝灭程度Cu2+>Pb2+>Cd2+>Co2+，Zn2+反而是增强溶液的荧光强度。这样的实验结果符合文献中提到的配合物的荧光发射特征，可推测金属离子与NADTBT之间形成了配位化合物[2]。

3.2 对铜离子的响应曲线

按实验方法，加入不同浓度的铜离子溶液，进行荧光光谱测定。实验结果如图9所示，在(1.00～9.00)×10-6mol/L范围内，荧光猝灭程度与加入的铜离子浓度呈良好的线性关系，测定的线性方程为F0/F=1.517 1×106CCu2++1.891 8，相关系数R=0.995 5。参照实验方法，平行测定不加入铜离子的空白溶液的10次荧光光谱值，求出标准偏差SD=0.161 01，检出限QL=3SD/K，K为标准曲线的斜率，可算出检出限QL=3.18×10-7mol/L。

图9 NADTBT溶液的荧光强度随铜离子浓度的线性变化曲线

3.3 共存离子的干扰

4 结 论

在0～5 ℃的恒温反应条件下，将1-萘胺和NaNO2溶液进行重氮化反应0.5 h后，将重氮化盐溶液按n(重氮化盐)∶n(2-巯基苯并噻唑)=2∶3滴加入2-巯基苯并噻唑乙醇溶液中，在pH值为7～8条件下反应时间为2 h，制得新型荧光探针试剂NADTBT。该荧光物质溶于乙醇，具有一定的荧光特性，最佳激发/发射波长为225 nm/366 nm，荧光量子产率为5.82%。多种金属离子可与NADTBT结构中的多个氮原子形成配位化合物，导致NADTBT荧光信号发生猝灭。对铜离子响应最为灵敏，在(1.00～9.00)×10-6mol/L范围内，铜离子浓度与荧光猝灭程度呈现良好的线性关系，线性回归方程为F0/F=1.517 1×106CCu2++ 1.891 8，相关系数r=0.995 5。