HPLC-MS/MS 法测定烟叶中 9 种 B 族维生素

刘萍萍，申娟娟，卢紫舒，李泽锋，张 慧，徐国云，王 晨，金立锋，曹培健，周会娜，陈千思*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

2. 郑州大学化学与分子工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道100 号 450001

植物是自然界中水溶性B 族维生素的主要制造者，但是人们对于植物体内B 族维生素的研究起步较晚。B 族维生素可以刺激植物的生长发育。烟草作为一种模式植物，其体内B 族维生素的含量和代谢特征均对烟草生长发育有较大影响［1-4］。准确检测植物体内B 族维生素的含量对了解其代谢途径和生理机制具有重要意义［5］。建立烟叶中B族维生素的高通量和高灵敏度检测方法有助于研究B族维生素对烟草植株生长发育的影响。

国际上常用的B 族维生素检测方法主要是微生物法［6］，该方法只能测定其中的某一组分且实验步骤较繁琐，样品用量较多［7］。由于B 族维生素种类较多，因此使用微生物法无法实现多种B族维生素的同时分离和测定。近年来，国内外学者围绕多种B 族维生素的同时测定进行了大量研究，建立的分析方法主要有高效液相色谱法（HPLC）［8-9］、薄层色谱分析法（TLC）［10］、差分脉冲伏安法（DPV）［11］以及液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）［12-13］等。其中液相色谱-质谱联用方法具有分辨率高、快速简便以及多组分同时分析等特点，适合于复杂基质样品的研究与分析［14-15］，逐渐成为B 族维生素的主要检测方法。目前，基于液质联用技术的烟草样品中B 族维生素的检测方法鲜见报道，因此，建立同时测定烟叶中9 种B族维生素的高效液相色谱-三重四极杆质谱（HPLC-MS/MS）方法，旨在为烟草中B 族维生素的准确测定提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

河南襄城县、贵州贵阳市、湖南郴州市鲜烟叶样品均采自当地主栽品种，采集成熟期第10 叶位新鲜烟叶，样品采集后迅速用液氮速冻，用干冰运输，在-80 ℃冰箱储存。

甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；盐酸（AR，天津博迪化工有限公司）；甲酸（质谱纯）、甲酸铵（质谱纯）、VB1（99%）、VB2（98%）、VB3（99.5%）、VB5（98%）、VB6（98%）、VB7（99%）、VB9（标 准品）、VB12（标准品）、VB16（99%）（美国 Sigma 公司）。

1260-6490 液相色谱-三重四极杆质谱联用分析仪（美国Agilent 公司）；Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）（美国Waters公司）；PP020XXM1 超纯水仪（英国Veolia 公司）；KQ-700DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；J-26XP 高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter 公司）；WondaDisc 针式过滤器（0.45 μm 滤膜，日本Shimadzu 公司）；pH 计（上海雷磁仪器厂）；高通量组织研磨仪（德国Retsch 公司）。

1.2 样品处理与分析

用液氮速冻新鲜烟叶（河南襄城县，成熟中部叶，品种K326），冷冻干燥后用粉碎机打碎成粉末备用。取20 mg 冷冻保存的烟叶样品，加入1 mL提取剂（0.50 mmol/L 盐酸），迅速放入超声仪中避光超声40 min。将样品在4 ℃，20 000 r/min 下离心10 min，取上清液用0.45 μm 滤膜过滤后进行HPLC-MS/MS 分析。所有操作都要避光低温，以减少B 族维生素的降解。

分别准确称取9 种B 族维生素标准品0.01 g，用超纯水溶解后转移至100 mL 棕色容量瓶中，用超纯水定容。该标准储备液须现配现用，其质量浓度为0.1 mg/mL。

HPLC-MS/MS 分析条件为：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：10 mmol/L 甲酸铵水溶液（pH=5）（A 相）和0.1%甲酸-甲醇溶液（B相）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。洗脱梯度：0 ～ 2.5 min，B 相由 0 升至 10.00%；2.5～ 5.0 min，B 相升至 10.50%；5.0 ～ 7.0 min，B 相升至10.90%；7.0 ～7.1 min，B 相升至 30.33%；7.1～ 10.1 min，B 相升至 30.50%；10.1 ～ 15.0 min，B 相升至31.00%；15.0 ～ 15.1 min，B 相升至100.00%；15.1 ～ 18.0 min，B 相保持在100.00%。

电离方式：电喷雾电离源，正离子电离模式；毛细管电压：4 kV；雾化气压力：275.79 kPa（40 psi）；干燥气流量：12 L/min；干燥气温度：290 ℃；鞘气流量：11 L/min；鞘气温度：350 ℃；检测方式：多反应监测（MRM）模式。9 种B 族维生素的质谱采集参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件优化

2.1.1 质谱参数的选择

对9 种B 族维生素标准溶液进行了MS 分析，9 种B 族维生素在正离子（ESI+）的模式下响应强度较高。其中，VB2、VB3、VB7、VB9、VB16主要产生［M＋H］＋准分子离子峰，其m/z分别为377.21、124.10、245.01、442.21、104.11；VB1在电喷雾电离时失去2 个盐酸分子，得到［M-2HCl+H］+准分子离子峰，其m/z为265.01；VB5又名D-泛酸半钙盐，由分子式可知，其在ESI+条件下电离时，先失去钙离子，然后断裂成2 个泛酸分子，形成［219+H］+准分子离子峰［16］，其m/z为 220.00；VB6则失去 1 个盐酸分子，产生［M-HCl+H］+准分子离子峰［17］，其m/z为170.11；VB12断裂成2 个分子，得到［M/2+H］+准分子离子峰，其m/z为678.81。

表1 B 族维生素的HPLC-MS/MS 分析的保留时间、定量离子对及碰撞能量Tab.1 Retention times, quantitative ion pairs and collision energies of B vitamins by HPLC-MS/MS

将9 种B 族维生素母离子的碎片离子（子离子）进行扫描，得到9 组信号较好，杂质干扰较小，重现性较高的离子对，分别是265.01/122.10、377.21/242.80、124.10/80.00、220.00/90.00、170.11/152.10、245.01/227.00、442.21/294.90、678.81/147.20、104.11/57.90。将这些离子对作为定量离子对，用于样品中9 种B 族维生素的定量分析。图1 为9 种B 族维生素质量浓度0.1 mg/mL 的标准溶液的离子提取色谱图。

2.1.2 流动相pH 的确定

图1 9 种B 族维生素的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of 9 B vitamins

分别配制 pH=2、3、4、5、6 的甲酸铵水溶液作为流动相，考察不同pH 甲酸铵水溶液作为流动相时9 种B 族维生素的离子化效果。以l gS（S为目标物色谱峰面积）作为选择标准，在各pH 下测定3次，结果取平均值。由图 2 可知，VB2、VB5、VB7、VB9、VB12在 pH=5 时信号响应强度最高，其他 4 种B 族维生素在pH=6 时信号响应强度最高。由于植物体内VB9和VB12的含量较低，且信号响应强度较弱，因此优先考虑这2 种B 族维生素信号响应值较高时对应的pH。经过综合分析，选择pH=5的甲酸铵水溶液作为流动相。

2.1.3 柱温的确定

柱温会影响目标物的分离效果，因此考察了柱温对B 族维生素响应值的影响。结果（图3）表明，在40 ℃时，B2、B6、B7、B9、B12的响应值最高，而B1和B16受柱温的影响较小。因此确定柱温为40 ℃。

图2 不同流动相pH 对9 种B 族维生素响应强度的影响Fig.2 Effect of mobile phase pH on response intensity of 9 B vitamins

图3 不同柱温对9 种B 族维生素响应强度的影响Fig.3 Effect of column temperature on response intensity of 9 B vitamins

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取剂浓度

烟叶中的成分非常复杂，样品在电喷雾离子源中电离时，存在离子增强和离子抑制效应，并且大部分B 族维生素在弱酸性环境条件下较稳定，在pH＜2.0 时则会发生降解［18］。因此，需要选择合适的提取剂，确保B 族维生素尽可能少地被破坏，以获得较高的响应信号，便于定量分析。根据B 族维生素的特性和相似相溶原理［19］，选择稀盐酸溶液作为提取剂，并对盐酸浓度进行了考察。比较了0、0.05、0.50、1.50、5.00、15.00、50.00 mmol/L盐酸溶液作为提取剂时的提取效果，结果（图4）显示，不同盐酸溶液浓度对B 族维生素的信号相应值有明显的影响，当盐酸溶液浓度为0.50 mmol/L时，VB1、VB2、VB6、VB7、VB12和VB16的响应值达到最高。因此，选择0.50 mmol/L 盐酸溶液作为提取剂。

图4 不同提取剂盐酸浓度对9 种B 族维生素响应强度的影响Fig.4 Effect of HCl concentration in extraction solvent on response intensity of 9 B vitamins

2.2.2 提取剂体积

在考虑样品提取剂中盐酸浓度的基础上，进一步探究样品提取剂体积对提取效率的影响。取20 mg 烟叶样品，分别用0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mL提取剂按照1.2 节方法对B 族维生素进行提取和分析。结果（图5）显示，提取剂体积对9 种B 族维生素检测结果有一定影响，其中 VB3、VB6、VB7、VB9和VB12在提取剂体积为1 mL 时响应值最高，VB1、VB2和VB16的响应值几乎不受提取剂体积变化的影响。综合考虑，选择提取剂体积为1 mL。

图5 不同提取剂体积对9 种B 族维生素响应强度的影响Fig.5 Effect of extraction solvent volume on response intensity of 9 B vitamins

2.3 方法验证

2.3.1 标准曲线、检出限和精密度

用9 种B 族维生素的混合标准储备液配制不同浓度的混合标样系列工作溶液，按照1.2 节方法进样检测，重复测定3 次，以标准溶液质量浓度为横坐标（X），目标组分定量离子的峰面积平均值为纵坐标（Y），进行线性回归分析。采用稀释混合标准溶液的方法测定9 种B 族维生素，以3 倍信噪比确定检出限。9 种B 族维生素的线性方程、决定系数（R2）及检出限见表 2。可以看出，9 种 B 族维生素在线性范围内的决定系数R2为0.994 6 ～0.999 9。VB12的检出限最低，为 0.01 ng/mL；VB1的检出限最高，为0.50 ng/mL；其余B 族维生素的检出限在0.02 ～0.40 ng/mL 之间。可见，本方法线性较好，灵敏度较高。

表2 9 种B 族维生素的线性方程、决定系数和检出限Tab.2 Linear equation, determination coefficient（R2）and limits of detection（LODs）of 9 B vitamins

将烟草样品按照1.2 节方法进行处理和检测，连续测定3 d，每天测定5 次，以考察方法的精密度。结果（表3）显示，RSD 均小于10%，说明方法的精密度和稳定性较好。

表3 9 种B 族维生素测定结果的日内和日间精密度Tab.3 Intra-and inter-day precisions of analytical results of 9 B vitamins (%)

2.3.2 回收率

由文献［20］可知，基质效应的评定方法主要有两种，本研究中采用的是提取后添加法，同时考察了提取回收率。对已知B 族维生素浓度的烟草样品进行加标回收率实验，测定目标物在高、中、低3 个水平下的回收率，每个水平重复5 次。由表4 可知，9 种 B 族维生素的平均回收率在 91.00% ～108.79%之间，RSD 为0.34% ～ 5.04%，说明本方法较可靠。

2.4 烟叶样品的检测

采用本方法对河南襄城县、贵州贵阳市、湖南郴州市3 个产区成熟期第10 叶位烤前鲜烟叶进行了测定，结果见表5。可以看出，不同产区间烟叶中B 族维生素含量有一定差异，相较于其他产区，河南襄城县产区烟叶中VB2、VB7、VB9含量较高，贵州贵阳市产区烟叶中VB3含量较高。

表4 9 种B 族维生素的加标回收率和RSD（n=5）Tab.4 Spiked recoveries and RSDs of 9 B vitamins（n=5）

表4（续）

表5 3 个烟叶样品中9 种B 族维生素的检测结果Tab.5 Test results of 9 B vitamins in 3 tobacco leaf samples (μg·g-1)

3 结论

建立了鲜烟叶中 9 种 B 族维生素（VB1、VB2、VB3、VB5、VB6、VB7、VB2、VB12和 VB16） 的HPLC-MS/MS 分析方法。本方法的回收率为91.00% ～108.79%，日内和日间精密度（RSD）为1.25% ～ 9.73%，9 种 B 族维生素的检出限为 0.01 ～0.50 ng/mL。利用建立的方法对3 个不同产区烟叶中9 种B 族维生素化合物进行了检测，结果表明不同产区间烟叶中B 族维生素含量有一定差异，相较于其他产区，河南襄城县产区烟叶中VB2、VB7、VB9的含量较高，贵州贵阳市产区烟叶中VB3含量较高。本方法简单、快速、灵敏，适用于烟叶中多种B 族维生素的同时分析。