荧光定量PCR法与胶体金法检测沙眼衣原体的比较

吴胜星 黎运西 潘锦玲

广东省中山市陈星海医院，广东中山 528467

据有关资料显示，沙眼衣原体（chlamydia trachomatis，CT）是性疾病传播的主要病原体。目前，我国CT感染率越来越高，其主要是因为频繁感染、抗生素使用不合理引起的[1]。男性CT感染后，极易出现前列腺炎、附睾炎及尿道炎等；而女性在感染CT后，很容易出现子宫内膜炎、宫颈炎、盆腔炎、尿道炎及前庭大腺炎等[2]，与此同时，部分则会合并慢性盆腔痛、异位妊娠、肛周炎及不孕症等并发症[3]。此外。因为CT造成的慢性子宫颈炎也是诱发宫颈癌的主要因素[4]。本研究主要针对荧光定量PCR法与胶体金法在沙眼衣原体检测中的应用效果进行深入分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采集本院2017年3月～2018年3月接收的200例进行婚前检查人群的标本，分别是尿液标本与宫颈分泌物。年龄22～30岁，平均（26.4±0.9）岁。病理检查结果：10例恶性，190例良性。经医院伦理委员会批准；纳入标准：（1）具备完整临床资料；（2）具备正常沟通、理解能力；（3）自愿签署知情研究同意书。排除标准：（1）合并肝脏、心脏及肾脏功能障碍；（2）存在精神异常及心理障碍；（3）合并传染疾病史；（4）伴有凝血功能障碍者。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 针对女性疑似病患标本，采集过程中，首先，对受检人员局部皮肤进行消毒，在受检人员尿道口插入经灭菌处理的棉拭子，深度控制在2cm左右，停留大约10s，旋出棉拭子。在外阴位置出现部分病症后，利用棉拭子擦取周围分泌物，如果是阴道分泌物，擦拭留取可采用无菌长棉拭子。每位患者标本采集两份，一份立即采用胶体金法检查，另一个荧光定量PCR法检测。针对男性：首先，全面消毒尿道局部皮肤，然后反转包皮，通过专用的拭子对标本进行擦取；针对尿液标本，采用同样方法全部消毒局部皮肤，然后清洗包皮留样本。

1.2.2 仪器和试剂 CT核酸检测试剂盒（潮州凯普生物化学有限公司）、CT抗原检测试剂盒（立明衣原体快速检测试剂）。仪器有低温高速离心机和上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪器。

1.2.3 方法 通过荧光定量PCR法及胶体金法对CT进行检测。荧光定量PCR法：严格按照试剂说明书操作。将有细胞保存液的样本管在涡旋振荡器上充分振荡混匀，取800μL样本加入1.5mL离心管，13000r/min离心1min，弃上清液。加入500μL细胞保存液，振荡混匀，13000r/min离心1min，弃上清液。加入50μL细胞裂解液，振荡混匀，100℃加热 10min，13000r/min离心 10min，保留上清备用。取上清2μL作为PCR扩增的模板，上机检测。最后仪器自动标出标准曲线，标准曲线相关系数r＞0.990，外部质控、阳性对照、标准品均为阳性，阴性对照的CT值无任何数值，可判断实验结果有效，否则实验无效。

胶体金法：根据沙眼衣原体抗原检测试剂说明书开展，裂解样本获得沙眼衣原体抗原，将含有抗原的裂解后溶液添加到胶体金试剂的加样孔内，10～20min后读取数据。质控位置和测试位置均出现紫红色条带，表示样品中含有沙眼衣原体。

1.3 观察指标

分析胶体金法与荧光定量PCR法检测CT结果。

1.4 统计学方法

本研究数据采用统计学软件SPSS21.0，计量资料以（）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

CT检测过程中，荧光定量PCR检测敏感度、特异度和准确度分别为100%（182/182）、55.56%（10/18）和96.00%（192/200）；胶体金法检测敏感度、特异度和准确度分别为95.60%（174/182）、61.11%（11/18）、91.00%（185/200），荧光定量PCR检测准确率比胶体金法高，差异有统计学意义（χ2=3.983，P=0.046），见表1。

表1 分析胶体金法与荧光定量PCR检测CT结果

3 讨论

近年，沙眼衣原体（CT）感染深受全球范围的重视，而且感染人数越来越多。据有关资料显示[3]，全球至2008年，新发现沙眼衣原体感染患者达到1.06亿，到2010年，全球新感染CT患者已经达到2.15亿。特别是广东省，生殖道沙眼衣原体感染率不断提高。相关研究显示[5]，沙眼衣原体感染无症状患者中，70%为女性，而50%为男性。若未及时诊治，很容易造成逆行感染，女性则会出现死胎、盆腔炎、流产、输卵管炎及不孕不育等[6]；而男性则会出现不育、附睾炎及前列腺炎等。所以，应及早诊断和筛查沙眼衣原体[7]。CT是泌尿生殖道感染常见的一种病原体，常用检测方法有免疫胶体金法、涂片法、药敏培养法及细胞培养法等。细胞培养法被视为检测CT的金标准[8]。但是，因为常见检测方法需要长时间，且可靠性差、敏感性低，进而通常无法为临床诊治提供重要参考数据，而荧光定量PCR法可扩增目的基因，杂交特异分子，且融合了化学荧光发光法，于封闭环境中，可进一步增加过程中，分析产物[9]。与此同时，利用计算机调控，可达到动态及自动化检测，具有较高的检测灵敏性，而且准确性高，可在短时间内完成检测[10]。

随着荧光定量PCR技术的发展，其被应用于基因检测中，而且该方法随着基因产物的增加荧光信号强度越来越强，所以，应于每次循环后对一次荧光信号进行收集，其可以获取荧光扩增曲线[11]。扩增曲线包括三个阶段，分别是平台期、荧光信号指数阶段及荧光背景信号极端[12]。所以，在PCR判定中放入CT值。在样本CT值低于37时，检测结果为40时或者无CT值时，检测结果则为阴性。如果CT值处于37 ~ 40间，则表示处于灰样区，说明需要复检[9]。

经本研究可知，CT检测过程中，荧光定量PCR检测敏感度、特异度和准确度分别为100%（182/182）、55.56%（10/18）和 96.00%（192/200）；胶体金法检测敏感度、特异度和准确度分别为 95.60%（174/182）、61.11%（11/18）、91.00%（185/200），荧光定量PCR检测准确率比胶体金法高，差异有统计学意义（χ2=3.983，P=0.046）。由此可见，荧光定量PCR法在CT检测效果方面比胶体金法更优，该方法是一种操作简单、方便、快捷的检测方法。因为荧光定量PCR法在特异性方法存在一定不足，所以，荧光定量PCR法检测CT过程中，应加强对假阳性的重视，避免误诊现象的发生。所以，临床上应联合胶体金法与荧光定量PCR法，将两者优势充分发挥出来，促进CT检测准确性及敏感性的提高。

据有关资料显示[13]，常规细胞培养方法是检测的金标准，在细胞培养结果呈阴性或者阳性而胶体金或者聚合酶连反应检测结果提示为阳性，则说明该标本检测结果为阳性。因为本研究条件有限，未进行细胞培养法，所以，只可以用于判定真阳性的依据。

综上，本研究过程中，无论是荧光定量PCR法，还是胶体金法，两者都有着各自的优点和缺点，但是，从整体角度来看，荧光定量PCR法优点更多，包括操作方便、简单、检测时间短、重复性好、准确度高、敏感性高等，而且其可以减轻疼痛，防止标本与标本间的差异。而且通过荧光定量PCR法可定量检测病原体，除在疾病诊断中具有效果，而且也可以被应用于监控和调查流行病，并研究分子生物学和遗传学，除此之外，其同样可被用于肿瘤疾病预后判定、分型及诊断中[14]。

总而言之，沙眼衣原体临床检测过程中，荧光定量PCR法相比于胶体金法效果更为明显，其除了具有操作简单、检查时间短、方便等特点外，而且其敏感性高，值得推广、采纳。