解整合素-金属蛋白酶9在小鼠酒精性肝纤维化过程中的表达

宋晓改， 李三强， 文 馨， 郭 威， 李子昂， 宋琢爽， 魏鹏雪， 王同园， 杨 欢， 朱文枫， 张兵兵

河南科技大学医学院肝脏损伤与修复分子医学重点实验室 河南科技大学第二附属医院 河南省肝病防治工程技术研究中心，河南 洛阳 471000

肝纤维化是慢性肝病重要的病理生理过程,由慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、药物性肝损伤等病因引起，病变严重且持续进展者可发展为肝硬化[1]。近年研究发现，解整合素-金属蛋白酶(ADAMs)在炎症反应、肿瘤发生发展转移、免疫性疾病和过敏反应疾病中有重要作用[2-3]。解整合素-金属蛋白酶9(ADAM9)是依赖锌离子的跨膜蛋白ADAMs家族的一员[4-5]。本实验用Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导小鼠酒精性肝纤维化动物模型，探讨ADAM9在小鼠酒精性肝纤维化过程中的表达。

1 材料与方法

1.1 材料动物：健康SPF级C57BL/6J雄性小鼠，体质量(20±2)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

试剂和饲料：无水乙醇，抗ADAM9单克隆抗体，美国圣克鲁斯生物技术公司； 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司生产；谷草转氨酶(AST)检测试剂盒，洛阳恒恩生物科技有限公司；Lieber-DeCarli液体饲料，南通特洛菲饲料有限公司。

仪器：008AS全自动生化分析仪，日本日立公司产品；JY300C电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司产品；酶标仪，美国BioTek公司；TY-80A/S脱色摇床，常州荣华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备：将50只C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常组10只和实验组40只。正常组用Lieber-DeCarli TP4030C对照液体饲料喂养8周。实验组小鼠用Lieber-DeCarli TP4030A酒精液体饲料喂养4周后联合5%四氯化碳橄榄油溶液2 ml/kg，腹腔注射，2次/周，共8周诱导小鼠酒精性肝纤维化，于0、2、4、6和8周分别随机挑取4只小鼠进行眼球取血制备血清，然后颈椎脱臼处死小鼠并分离肝组织。造模过程中小鼠无死亡。

1.2.2 血清AST活性的检测：采用全自动生化分析仪检测血清中AST的活性[6]。

1.2.3 蛋白印迹法检测肝组织ADAM9的表达量：用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，然后取50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后电转移至硝酸纤维素膜上，质量浓度为50 g/L脱脂奶粉37 ℃封闭60 min；一抗(1∶500)，37 ℃温箱孵育1 h；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶500)，37 ℃孵育l h，最后DAB显色，检测ADAM9表达量。用Gel Pro 4.0软件分析蛋白条带，β-actin作为内参。被检测的目的蛋白相对表达值=目的蛋白条带灰度/β-actin蛋白条带灰度值。

1.2.4 免疫组化法检测小鼠肝组织中ADAM9阳性表达面积：用免疫组化法对小鼠肝组织进行脱蜡、水化、PBS冲洗，血清封闭。加入ADAM9抗体(1∶200)，于37 ℃ 孵育1 h；二抗孵育后，冲洗，显色，自来水冲洗终止反应，复染、脱水、透明及封片，普通显微镜下观察组织切片染色结果。用MoticamPro 285A数码显微系统进行拍照。用Motic Images Advanced 3.2软件对免疫组化染色结果进行分析。

2 结果

2.1 血清AST活性比较C57BL/6J小鼠经Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养的0、2、4、6、8周AST活性分别为(110±14)U/L、(163±52)U/L、(200±26)U/L、(229±17)U/L、(509±111)U/L，与0周小鼠相比，6周AST活性显著升高(P<0.05)，且随着时间的延长，8周与0周相比AST活性升高更加显著(P<0.01，见图1)。

注：与0周小鼠比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各周小鼠肝脏病理学比较

2.2.1 天狼星红染色观察不同时间点肝组织纤维化程度：普通光学显微镜下0周小鼠肝组织小叶结构基本完整，中央静脉分布均匀，数量及形态基本正常，未见脂肪变性改变。2周时出现甘索紊乱，有轻度病理改变。4周时明显出现肝细胞脂肪变性，汇管区大量炎细胞浸润，所显示组织结构与HE染色有相同效果。肝脏脂肪的沉积具有多样性和沉积区域的不一致性，主要聚集在肝静脉及门静脉、肝小叶静脉区及其周围。6周可以看出有轻度的肝纤维化，普通光镜下，中央静脉壁及窦周网状纤维经天狼星红染色呈红色，窦周可看出窦周网状纤维增粗。8周可以清晰看到炎灶中红染的胶原沉积，红染的胶原纤维突出显示汇管区周围和窦周的纤维化，纤维伸入小叶内，故此，我们可以借天狼星红复加苏木素对比染色核的方法判断纤维化与病变间的关系(见图2)。

注：A、B、C、D、E分别代表0周、2周、4周、6周、8周病理切片。观察发现随着喂养时间增加，肝纤维化越来越严重。

2.2.2 各周肝组织病理Ishak评分比较：按文献[7]进行肝纤维化Ishak评分，0分：无纤维增生；1分：有部分纤维增生，纤维隔膜少或无；2分：有较多的纤维增生，纤维隔膜有或无；3分：有较多的纤维增生，纤维桥连偶见；4分：有较多纤维增生，纤维桥连明显；5分：明显的桥连，偶见不完全硬化性结节；6分：明确或可能有肝硬化(见表1)。与0周比较，6周、8周肝纤维化Ishak评分显著上升(P<0.01)，表明ADAM9可能在酒精性肝纤维化过程中起到促进作用。

表1 各周小鼠肝纤维化Ishak评分比较

2.3 光镜下小鼠肝组织病理切片免疫组化结果光镜下检测小鼠肝组织病理切片免疫组化结果显示，2周后阳性面积逐渐增加，肝脏损伤越来越重。结果显示，ADAM9在酒精诱导的小鼠肝纤维化过程中起到促进作用(见图3)。

注：A、B、C、D、E分别代表0周、2周、4周、6周、8周小鼠肝脏阳性表达情况(放大200倍);F:小鼠肝组织免疫组化阳性表达百分比。用Images软件对每只小鼠至少10 mm2的肝脏切片组织进行测量分析。与0周相比，**P<0.01；与2周相比，##P<0.01；与4周相比，&&P<0.01。每次实验重复3次。

3 讨论

本研究结果显示，ADAM9表达量在小鼠酒精性肝纤维化过程中呈显著变化，ADAM9在Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导的酒精性肝纤维化过程中起到了重要作用。小鼠在液体饲料喂养4周后，ADAM9表达量显著升高，这与血清中AST的活性变化一致；随着喂养时间增加，ADAM9表达量逐渐升高。说明ADAM9表达量与肝损伤程度呈正比[8]。本实验说明Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养小鼠引起了严重的肝损伤以致肝纤维化,而ADAM9在肝纤维化过程中起到了促进肝纤维化的作用。

ADAMs也叫金属蛋白酶解聚素。ADAM9功能广，涉及到细胞聚集、细胞融合、细胞迁移、膜蛋白的脱落等很多方面，目前为止，文献报道的ADAMs家族成员共有30余种[9]。ADAM9是ADAMs家族的重要一员，与多种疾病密切相关[10-13]。ADAM9广泛表达于人和其他哺乳动物的各种组织中，作为ADAMs家族重要成员，ADAM9具有多个特征结构域的跨膜蛋白，其去整合素域能和多种整合素结合[14]；此外，ADAM9还介导FGF细胞信号通路，参与调节胞内信号传导过程[15]。有研究显示，Schwettmann等[16]发现各种不同病因所致的肝脏疾病，其活化的肝星状细胞中ADAM9 mRNA表达水平明显高于未活化的肝星状细胞的表达水平。韩红梅等[3]研究表明，ADAM9在急性肝损伤过程中可能起到重要的促进作用。目前，ADAM9在酒精性肝纤维化发病与进展过程中的表达及其临床意义国内外很少有研究报道。而本实验进一步阐明ADAM9在肝纤维化中的重要作用，发现ADAM9在Lieber-DeCarli酒精液体诱导的肝纤维化过程中具有重要的促进作用，这为临床在诊断和治疗酒精性肝纤维化的发病机制提供新的思路和方法。