长春地区幽门螺杆菌耐药性与毒力基因相关性分析

蒋 洁，于 军，江海洋，李兆雪，王丽波，赵春燕

1.吉林大学基础医学院病原生物学系，吉林 长春 130021； 2.吉林大学第一医院小儿消化内科

幽门螺杆菌(H.pylori)是引起慢性胃炎、消化性溃疡、胃腺癌、胃黏膜淋巴组织相关肿瘤等疾病的重要病原菌[1]。H.pylori感染在全世界都很常见，不同国家的感染率有较大差异[2-3]。2009年至2016年，全世界有44.9%的人伴有H.pylori感染[4]，而在中国平均感染率高达55%[5]。目前，克拉霉素(CLA)、甲硝唑(MTZ)等抗生素在H.pylori根除治疗中起着重要作用[6]，但近年来由于临床上抗菌药物的不合理使用，世界各地H.pylori的耐药率呈逐年上升的趋势，给H.pylori的根除治疗带来困难[7-8]。因此了解H.pylori耐药性及耐药机制与规律，对于根除治疗H.pylori有着重大意义。

研究表明，年龄、性别、患病史、地域对于H.pylori的抗生素耐药性均有影响[9]，但H.pylori耐药性与毒力相关基因cagA、vacA、iceA之间的相互作用尚未完全明确[10]。国外曾有研究报道了意大利西西里岛地区H.pyloriCLA耐药性毒力基因的相关性，国内也有研究报道西安、贵阳、江西等地区H.pylori与毒力基因的相关性，但长春地区尚未见到相关报道。本研究中，我们在长春地区分离的69株H.pylori对阿莫西林(AMX)、CLA、左氧氟沙星(LFX)、呋喃唑酮(AOZ)、MTZ、盐酸四环素(TET)、替硝唑(TNZ)的耐药性进行检测，同时检测cagA、vacA、iceA基因及其亚型毒力基因分布，运用统计学方法分析二者之间的关联性。

1 材料与方法

1.1 菌株来源2014年9月至2017年10月在吉林大学白求恩医学院第一医院分离鉴定得到的69株H.pylori。

1.2 耐药性检测采用琼脂稀释法测定H.pylori对AMX、CLA、LFX、AOZ、MTZ、TET、TNZ的敏感性，参照美国临床试验标准委员会(NCCSL)制定的标准判定结果。

1.3 毒力基因检测提取分离菌株DNA，PCR扩增cagA、vacA、iceA基因及其亚型，PCR的扩增引物体系和扩增条件参照相关文献进行[11-13]。

1.4 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，对毒力基因和抗菌药物的耐药性进行比较。使用χ2检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1H.pylori分离菌株耐药性H.pylori对抗生素的耐药性结果见图1。其中对CLA、MTZ、TNZ、AMX、LFX、TET和AOZ耐药率分别为52.17%(36/69)、30.43%(21/69)、47.83%(33/69)、5.80%(4/69)、37.68%(26/69)、33.33%(23/69)、30.43%(21/69)。CLA耐药率最高，AMX耐药率最低。

图1 H.pylori对7种抗生素的耐药率

2.2H.pylori分离菌株毒力基因分布69株H.pylori菌株中cagA毒力基因阳性检出率为89.86%(62/69)；vacAs1、vacAs2、vacAm1、vacAm2、vacAi1和vacAi2基因阳性检出率分别为78.26%(54/69)、21.74%(15/69)、46.38%(32/69)、53.62%(37/69)、71.01%(49/69)、28.99%(20/69)，mixs1的检出率为14.49%(10/69)；iceA1、iceA2基因阳性检出率分别为81.16%(56/69)、15.94%(11/69)，混合株mixiceA检出率为2.90%(2/69)。vacA的等位基因s1明显高于s2的阳性检出率，m区基因亚型以m2为主，i区等位基因i1阳性检出率明显高于i2。iceA1阳性检出率明显高于iceA2(见表1)。

表1 69株H.pylori毒力基因分布

2.3 毒力基因分布与耐药性的关系

2.3.1cagA基因与H.pylori耐药性之间的关系：H.pylori毒力基因cagA在耐药和敏感菌株间的分布差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 抗生素耐药性与cagA基因之间的关系

2.3.2vacA基因s区各亚型与H.pylori耐药性之间的关系：H.pylori毒力基因vacAs1a阳性菌株在MTZ的耐药和敏感株间的分布差异有统计学意义(P=0.034)，即vacAs1a阳性菌株对MTZ的耐药率更高，而在其余6种抗生素之间差异无统计学意义(P>0.05)。vacAs1c阳性菌株对MTZ、CLA和LFX三种抗生素更敏感(P=0.013；P=0.009；P=0.008)(见表3)。

表3 抗生素耐药性与vacA基因s区之间的关系

2.3.3vacA基因m区各亚型与H.pylori耐药性之间的关系：H.pylori毒力基因vacAm1a阳性菌株在TET的耐药和敏感菌株间的分布差异有统计学意义(P=0.017)，即vacAm1a阳性菌株对TET更敏感，在其余6种抗生素之间差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表4 抗生素耐药性与vacA基因m区之间的关系

2.3.4vacA基因i区各亚型与H.pylori耐药性之间的关系：H.pylori毒力基因vacAi1阳性菌株在TNZ的耐药和敏感菌株间的分布差异有统计学意义(P=0.018)，即vacAi1阳性菌株对TNZ更敏感，在其余6种抗生素之间差异无统计学意义(P>0.05)(见表5)。

表5 抗生素耐药性与vacA基因i区之间的关系

2.3.5iceA基因各亚型与H.pylori耐药性之间的关系：H.pylori毒力基因iceA1阳性在CLA、AOZ、TNZ的耐药和敏感株间的分布差异有统计学意义(P=0.003；P=0.042；P=0.047)，即iceA1阳性对CLA和TNZ耐药率较高，而对AOZ更敏感，在其余4种抗生素之间差异无统计学意义(P>0.05)。在iceA2基因中与7种抗生素之间差异无统计学意义(P>0.05)(见表6)。

表6 抗生素耐药性与iceA基因之间的关系

3 讨论

随着抗菌药物的广泛应用，在全球范围内H.pylori的抗生素耐药性明显增加，其中CLA耐药尤其明显，导致抗生素的治愈率一直在降低，成为H.pylori治疗的一大难题[14-16]。本研究显示，CLA耐药率为52.17%，明显高于其他6种抗生素的耐药率，MTZ和TNZ的耐药率也相对较高，分别为30.43%和47.83%。AMX的耐药率最低，仅为5.80%，可继续作为一线抗菌药物使用。

在本研究中，69株H.pylori菌株中，cagA检出率达89.86%，但H.pylori菌株cagA基因与抗生素耐药性无相关性，这与Alarcón-Millán等研究结果一致，表明cagA基因与抗生素耐药性无相关性[17]，但也有研究报道，cagA阴性菌株会使根除率下降，即具有较强的耐药性，应使用高剂量的抗生素进行治疗，cagA阳性菌株对抗生素更敏感，因为毒力因子诱导炎症细胞因子的释放，而炎症反应会导致黏膜的血管扩张和血流加速，从而加快了抗生素的扩散，这与Taneike等研究结果一致[18-19]。意大利的一项研究也发现，cagA阴性与CLA耐药性密切相关[20]。

本研究表明vacA基因与抗生素的耐药性密切相关。其中，H.pylori毒力基因vacAs1a阳性菌株对MTZ的耐药率更高，vacAs1c阳性菌株对MTZ、CLA和LFX三种抗生素更敏感；vacAm1a阳性菌株对TET更敏感；vacAi1阳性菌株对TNZ更敏感，AMX与TNZ的耐药性和毒力基因vacAm1a之间以及CLA的耐药性与毒力基因vacAi1之间的差异是否有统计学意义应该扩大样本量继续分析。一项研究发现，H.pylorivacAs1a/m2基因与抗生素耐药率升高有关[21]，而在意大利西西里，有研究发现，vacA基因与CLA耐药性无关[20]，江西地区也有报道儿童H.pylori临床分离菌株的毒力基因型vacA与抗生素耐药无关[22]。本研究还发现，H.pylori菌株iceA基因与抗生素的耐药性密切相关，iceA1阳性对CLA和TNZ耐药率较高，对AOZ更敏感，而iceA2基因与7种抗生素耐药性无关。但有研究报道儿童H.pylori临床分离菌株的毒力基因型iceA与抗生素耐药无相关性[22]。

综上所述，本研究发现H.pylori菌株cagA基因与抗生素耐药性无相关性，而vacA和iceA基因与抗生素的耐药性密切相关。对于耐药性和毒力基因之间是否具有相关性的研究目前国内外尚无确切的结论。不同国家和地区的抗生素使用习惯导致各地区的研究结果不尽相同：有些研究显示毒力基因阳性的耐药性更强，而有的则是阴性的耐药性更强；基因型及其亚型的组合不同导致的耐药性也出现差异；药物不同基因型的耐药情况也不一致。这可能是不同地区的基因型存在差异以及临床根除H.pylori感染使用抗生素的习惯不同所导致，也可能与宿主本身差异有关。因此考虑到毒力基因的区域和人群等差异性，还需大量不同样本研究两者的关系。本研究通过对H.pylori毒力基因和耐药性的检测和分析，初步了解H.pylori主要毒力基因的多态性与其地域聚集性之间的关系，分析了本地H.pylori的耐药水平，对于研究H.pylori感染后疾病的转归、提高H.pylori根除率、降低胃癌发生风险、减少患者痛苦以及减轻患者经济负担等方面均有重要意义。