基于强化推流工艺(PFR)的餐厨垃圾堆肥微生物群落结构解析

阎 中， 王婧瑶， 王凯军

(1.清华大学 环境学院， 北京 100084; 2.北京中源创能工程技术有限公司, 北京 100084)

随着中国城市化进程加快，餐厨垃圾也在不断加剧产生[1]。餐厨垃圾是指家庭、食堂和酒店等餐饮业所产生的食品残渣，在城市垃圾中所占比例高达50%，有机质含量通常可达85%以上[2]，其BOD高，易腐败、发酵并产生恶臭，含水率高，不方便运输，处理不当容易产生渗沥液等二次污染物[3]。在美国等发达国家，餐厨垃圾的资源化利用和无害化处理早已法制化和商业化，而我国的餐厨垃圾环保化处理还处于初级阶段。目前，餐厨垃圾的处理方式主要有粉碎法、填埋法和生物处理法[4]。生物处理法因其环保效益明显，不产生二次污染，能够有效地实现对废弃物的资源化利用，是当下研究的热点。生物处理分为好氧发酵和厌氧发酵两种。厌氧发酵由于有机物分解缓慢、发酵周期长(4～6个月)、占地面积大而不适合大规模的有机废物处置。现代工艺大多采用高温好氧堆肥，其无害化程度较高、减量化效果较为明显，可以最大限度地实现餐厨垃圾的资源化。

好氧堆肥是微生物利用有机质的好氧发酵过程。在该过程中餐厨垃圾中的可溶性小分子物质通过细胞壁和细胞膜被微生物吸收利用，而不溶性大分子有机物则附着在胞外并由胞外酶分解为可溶性小分子物质。有机物经过水解、脱羧、脱氨基被降解：一部分被氧化成无机物，释放能量提供给生命活动所需，一部分降解为小分子后重新合成新的大分子物质如腐殖质，另一部分有机物被合成新的细胞物质，微生物得到增殖[5-6]。由于堆肥处理无害化程度高，运行成本低，长久以来被国内外广泛应用于固体废弃物的无害化处理。大量研究表明，好氧堆肥对于大部分菌渣或其他固体废弃物堆肥均具有很好的降解效果[7]。对于餐厨垃圾好氧堆肥的研究虽然已经持续很多年，但是主要是考察发酵效果，对其理化因子方面的分析比较多，对于微生物群落的分析则较少[8]。

微生物菌剂的种类与含量是影响有机垃圾堆肥降解进程的重要因素。研究发现餐厨堆肥过程是一个由细菌、放线菌、真菌等微生物共同作用，并且在不同堆肥阶段由不同优势微生物群落互相演替的过程。微生物菌剂复配方案如米曲霉、地衣芽孢杆菌、解脂假丝酵母、绿色木霉和褐球固氮菌联合强化了厨余垃圾中脂肪、蛋白质等特异组分的降解[9]。席北斗[10]等将污泥和有机生活垃圾的混合堆肥中添加复合微生物菌剂，复合微生物菌群各菌种之间相互协同作用，生成抗氧化物质，形成复杂而稳定的生态系统，与灭活菌的对照组比较，堆肥腐熟时间可缩短6～18天。菌剂的种类对堆肥结果的影响很大[11]。Akansha Bhatia[12]等培养不同微生物对有机垃圾好氧堆肥的影响，得出微生物对底物的分解消化具有阶段性，其群落结构出现更替现象，表现出丰富的多样性及明显的优势微生物。

传统工艺在此之前需要较长启动期才能实现温度积累、微生物增殖等预过程，且大多是由国外引进的工艺。德国约70%的堆肥厂使用的仍是静态条垛式等低成本堆肥工艺，英国在条垛式对非系统的基础上计入强制通风装置，显著减少了发酵时间，但是仍存在占地面积大、环境条件依赖性高等问题。因此，丹麦开发了基于连续式动态好氧堆肥工艺的Dano滚筒式发酵仓、韩国Geoen Tech公司与德国Fethmann公司合作开发了集装箱堆肥法。尽管国外已经对好氧堆肥技术有了一定的的研究与推广，但传统技术仍然存在着占地面积大、人员多、产品单一等问题，而面对国内有机垃圾处理现状及特定需求，还存在着预处理技术不完善、微生物菌剂多组分适微生物菌剂多组分适应性差、能耗高、辅料添加量大等问题，长期制约着有机垃圾的资源化处理。

有机垃圾在高温发酵阶段才真正实现底物的微生物高效降解，因此，本研究结合餐厨垃圾产生、收集及处理规律，优化反应器构型，调控形成推流路径，开发了新型高温强化PFR反应器，其可实现间歇进料与连续出料。PFR反应器是厌氧消化领域常用的反应器。理想的PFR不将底物与所有物料完全混合，而是与部分物料混合后从反应器的进料端进入反应器，使其在反应器长度方向呈活塞方式依次向前推进，直至反应器的出料端出料[13]。同时，PFR不需要搅拌，尤其是在面对高含固率有机物(如畜禽粪便、农作物秸秆)的发酵处理时，减小了动力消耗，降低了运行成本[14]。本研究开发的分格式反应器，实现了发酵过程运行参数分区控制，充分发挥不同区域内微生物菌群作用，同时利用菌渣分离方式和多舱推流式设计，突破了现有技术批次反应的限制，实现餐厨垃圾连续进出料处理。

因此，本文利用EM菌种和高温强化PFR连续发酵技术，通过分析德清县11个项目实际运行中的微生物群落分布，以了解好氧堆肥的实际工业化过程中底物成分和不同负荷条件下微生物的多样性及其变化，从而为餐厨垃圾的发酵技术和资源化处理提供工业指导。

1 材料和方法

1.1 项目点情况

为了研究德清县餐厨垃圾PFR工艺的运行情况，取钟管青墩、乾元、新市、筏头东沈、洛舍东衡村、筏头后坞、洛舍砂村、筏头、莫干山燎原、五四村和钟管蠡山11项目的出料(经过冷却3仓后静置24 h)，分别标记为样品01-QD，02-QY，03-XS，04-DS，05-DH，06-HW，07-SC，08-FT，09-MG，10-WS和11-LS，如表1所示。其中，餐厨垃圾主要包括未加工的腐烂食物原材料和食物加工过程中的下脚料；厨余垃圾主要包括剩菜剩饭，均取自项目当地的农家乐。

表1 德清县11个项目的有机负荷及底物成分

1.2 PFR工艺的运行

本研究案例中餐厨垃圾处理厂采用的是自主创新的小型强化连续多仓式推流发酵(PFR)技术工艺，反应器如图1所示，物料和菌种由1仓投加，物料缓慢流过2仓，最后到3仓腐熟，前两仓控温50℃～55℃，3仓为冷却仓。其中乾元、新市两个项目的反应器有效容积为23 m3，设计能力10 t·d-1；其余9个项目均为1.5 m3有效容积，日处理500 kg。

图1 PFR工艺示意图

2 结果与讨论

2.1 德清县11个项目的出料感官品质

微生物是堆肥发酵的主体，微生物数量和种类的变化不仅与臭味控制、氮损失密切相关，还与堆肥周期、堆肥质量紧密相关。表2展示了德清11个项目的出料情况，如果项目稳定较好的运行，则出料质地疏松，颜色金黄，有一种芳香气味；反之，则出料结球，颜色黑绿，气味恶臭。陈广银通过对蘑菇渣与落叶联合堆肥过程中养分变化的研究及堆肥产品理化性质的考察，指出在堆肥结束时，堆肥终产物较堆肥初期物料的物理性状有很大变化；此外在外观上，经过堆肥处理后的物料较干，颗粒变细，颜色呈黑褐色，有淡淡的泥土气味[15]。本研究结果表明09-MG样品与陈广银的出料感官表征相似，其余出料如下表2所示。

表2 德清县11个项目的出料感官品质

2.2 微生物群落多样性指数分析

Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性。本研究通过Shannon(香农指数)，Simpson(辛普森指数)，Chao1和ACE这4个指标对餐厨好氧发酵反应器中的群落Alpha多样性进行分析。其中，Chao1用来估计物种总数，ACE可估计群落中OTU数目，Simpson和Shannon用于估算微生物多样性，Simpson越大多样性越低，而Shannon越大多样性越高。

如表3所示，样品04-DS的多样性程度最低，其次是样品01-QD，02-QY和03-XS，但样品09-MG的多样性程度最高。当系统运行良好时，其能为微生物的生长提供更适宜的环境，进而增加微生物的多样性，香农指数升高。而当系统内可能存在有机酸以及其他有毒有害物质的积累时，某些敏感微生物生长受到抑制甚至死亡，从而导致微生物群落丰度与多样性的降低，香农指数减小[16]。由表3可知，样品09-MG由于较低的有机负荷率和更加丰富的底物而导致多样性较高，升高有机负荷率(如02-QY和03-XS)或者降低底物的丰富度(如06-HW和07-SC)均可使样品的多样性呈下降趋势。

表3 德清11个项目的Alpha多样性

2.3 微生物群落门水平多样性分析

研究表明，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是相对丰度最高的细菌门(见图2)。有研究表明，在市政污泥厌氧消化系统中，Firmicutes的相对丰度含量也很高，并且在厌氧消化过程中呈现出逐渐上升的趋势；此外该门类已被证明是一类重要的发酵细菌，并能产生胞外酶来水解有机质[17]。而Zamorano研究了添加餐厨垃圾后厌氧膜生物反应器的运行效果，发现反应器中的优势菌门为Chloroflexi，Firmicutes，Synergistetes和Proteobacteria[18]。

厚壁菌门(Firmicutes)在11个样品中均占了最大的部分(见图2)。在厚壁菌门中，大多数菌隶属于微小杆菌(Exiguobacterium)和乳酸菌属(Lactobacillus)，少部分隶属于葡萄球菌(Staphylococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)。厚壁菌门下的细菌多为革兰氏阳性菌，其细胞壁厚且90%以上为肽聚糖，能形成孢子，具有防止细胞分解的能力，因此能帮助菌株渡过不良的环境时期进而在极端环境中生存。隶属于厚壁菌门的细菌种类多样，系统发育距离宽泛。此外厚壁菌门中很多菌种被分离纯化，经研究发现这些菌的代谢特征表明：它们可利用的底物也是很多样，包括能直接作为底物被代谢的大分子蛋白与淀粉等。变形菌门(Proteobacteria)在11个样品中是另一优势菌门，种群主要集中在柠檬酸杆菌属(citrobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单胞菌(Pseudomonas)。

图2 德清县11个项目的样品微生物群落门水平多样性分析

Wang[19]研究了序批式有氧堆肥过程中不同的餐厨垃圾负荷下微生物群落的结构特征，证明餐厨的添加量超过每天的10%则会引起负荷扰动，10%以内则系统正常运行，同时经高通量测序后发现Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes和Actinobacteria是主要的菌门。任省涛[20]研究了污泥堆肥初始期、高温期和腐熟期的微生物群落，发现3个时期优势菌属不明显且种类较多，其相对丰度在1.01%到5.67%，各属之间更加均衡，这也从侧面表明污泥堆肥群落多样性较高。其中在初始期和高温期富集的属有Pseudomonas,Paracoccus,Bacillus,Gemmatimonas,Pseudosphingobacterium,Clostridiumsensustricto。在腐熟期富集的属有Actinomadura,Truepera,Luteimonas,Streptomyces和Exiguobacterium。

对污泥堆肥高温期细菌微生物群落多样性的影响，结果表明生物质碳影响了污泥堆肥过程中群落结构变化，所有添加生物质碳堆肥样本中主要门类均为Proteobacteria,Firmicutes和Chloroflexi，主要优势菌属为Pseudomonas,Acinomadura和Ureibacillus[21]。

2.4 微生物群落属水平多样性分析

由图3可以看出，11个样品中优势菌属类似，均为微小杆菌(Exiguobacterium)，乳酸杆菌(Lactobacillus)，柠檬酸杆菌(Citrobacter)，不动杆菌属(Acinetobacter)和假单胞菌(Pseudomonas)。

图3 德清县11个项目的样品微生物群落属水平多样性分析

样品04-DS有特异优势菌属葡萄球菌(Staphylococcus)，多数葡萄球菌能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产气，能分解甘露醇，但葡萄球菌作为一种化脓球菌，容易引起样品腐败[22]，因此，推测样品04-DS发酵失败系葡萄球菌大量繁殖所致，由于葡萄球菌大多是中温菌，在发酵前期高温50℃～55℃时本该得以杀灭，因此样本04-DS中其大规模增殖也从侧面反映出在实际运行过程中温控系统的不稳定性。

在本研究中，除了04-DS外，其余所有样品中微杆菌和乳酸菌为主要种属。根据样品11-LS的分析，葡萄球菌的存在并不会直接指征发酵失败的样本；但由于香农指数表明，葡萄球菌属大量繁殖的同时，其样品生物多样性降低；结合NETWORK图分析，与葡萄球菌属负相关的菌属为芽孢杆菌属，因此得出，葡萄球菌的大量扩繁抑制了对发酵有益的芽孢杆菌属的增殖。

对于样品01-QD和09-MG来说，两者的进料量均是每天200 kg左右，但是01-QD以厨余为主，而09-MG为餐厨和厨余的混合物。两者的聚类树也相聚最近，因此说明种属的组成相近，结合香农指数，样品09-MG的多样性程度较高，因此说明底物种类的单一导致好氧发酵过程中微生物群落的单一。然而，多物料协同处理可以优化工艺，提高稳定性。在席北斗的研究中，采用添加不同填充料来提高餐厨垃圾好氧堆肥的效果，添加锯末、树叶、秸秆和干马粪等有机质均能不同程度的提高发酵效果。因此，多底物混合有利于微生物群落多样性的丰富，提高发酵效果。

对比06-HW和1-QD，餐厨垃圾的发酵效果也好于厨余垃圾，这说明餐厨垃圾的成分比厨余垃圾更复杂。因为底物越复杂，营养就越均衡，好氧微生物所需要的酶系统就越多，也越综合，从而提高好氧堆肥技术处理餐厨垃圾的效果[23]。

在底物均为餐厨和厨余混合物来说，相较于02-QY和03-XS的进料量为4T来说，05-DH,08-FT和10-WS是200 kg左右，乳酸菌的含量是后者居多，结合香农指数来看，也是后者的多样性更丰富，这是由于过高的投料量会造成较高的负荷，导致有机物降解的种间产物积累，从而抑制菌群活性，不利于好氧堆肥。因此较小的进料量有利于好氧发酵。

2.5 微生物群落之间的相关性分析

结合图4的OTU相关性和图5的菌群相关性可知，在门水平上，绿弯菌门与酸杆菌门呈正相关，而与厚壁菌门呈负相关。酸杆菌门和梭菌门呈负相关。在OTU水平上，葡萄球菌属与芽孢杆菌属、根瘤菌属均呈负相关，这说明葡萄球菌(Staphylococcus)的迅速增殖很可能抑制了对发酵有益的芽孢杆菌属(Bacillus)和根瘤菌属(Rhizobium)的生长，因此导致发酵失败。乳酸菌属与杆菌属呈负相关，说明乳酸菌的生长可以抑制一部分杆菌的生长。

图5 德清项目样品菌群相关性

图4 德清项目样品OTU相关性

绿弯菌门是一种兼性厌氧生物[24]，具绿色素，是消耗葡萄糖的主要类群[25]，其和厚壁菌门都与碳氢化合物的降解相关[26]，且绿弯菌门的相对丰度随着餐厨垃圾比例的增加而增高[18]。推测这是由于发酵料含水量偏高，堆体偏紧实，其中的兼性厌氧菌发挥作用的结果。变形菌门中的许多种群与葡萄糖、丙酸盐、丁酸盐等小分子化合物的利用有关[27-28]，是工业污水处理厂和市政污水处理厂的污泥中常见的菌群。

3 结论与展望

本研究开发的PFR通过在反应器内设置不同发酵舱，并智能控制各区域的工况条件，实现微生物在反应器内的分相。基于物料推流过程中的菌渣分离，确保新鲜进料与高效成熟菌体充分接触和反应充分利用不同区域内的微生物种群，在提供高效发酵条件的同时，实现了连续进出料，处理效果不受进料频率影响，有机垃圾即产即清，提高了反应效率，极大降低对周边环境的影响；通过高通量测序分析获得PFR好氧餐厨垃圾处理工艺过程的微生物种群、数量、结构、动态变化规律等数据，为进一步优化餐厨垃圾处理工艺，促进PFR反应器系统的稳定和高效运行，挖掘特定功能微生物，提高餐厨垃圾发酵产物的资源化利用效率提供科学依据。

本研究的主要结论：1)11个项目的微生物群落组成相似，其中厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是相对丰度最高的2个从属于细菌的门，优势菌属为微小杆菌(Exiguobacterium)，乳酸杆菌(Lactobacillus)，柠檬酸杆菌(Citrobacter)，不动杆菌属(Acinetobacter)和假单胞菌(Pseudomonas)；2)底物越丰富，进料量越小，越有利于出料的品质；3)出料感官品质高，微生物多样性也较高；4)在OTU水平上，葡萄球菌属与芽孢杆菌属、根瘤菌属均呈负相关，葡萄球菌的迅速增殖抑制了对发酵有益的芽孢杆菌属和根瘤菌属的生长，因此导致样品04-DS的发酵失败；5)餐厨垃圾处理过程中的部分菌属可能具有资源-环境双重属性，例如在出料中相对丰度较高的Pseudomonas，既是常见的致病菌，也具有生产聚羟基脂肪酸酯的功能。

基于研究结果，提出以下对策建议：1)餐厨垃圾好氧PFR工艺优化：好氧PFR环境的群落组成结构可为反应过程性能提供参考，如厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)两者的相互作用可提高好氧堆肥过程的稳定性，降低环境因素变化对发酵过程的冲击。2)餐厨垃圾出料中存在假单胞菌属，该菌属已被证实具有将碳源转化为聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)的功能，可以对产PHA功能菌株进行筛选、发酵条件探索等一系列方案，以期进行资源的再利用和新型材料的生产。3)发酵失败的物料可能含有葡萄球菌属(Staphylococcus)等病原菌，直接排放可能对环境和人体健康带来影响，因此针对具有该菌属的出料需要再次选择与其相拮抗的菌种进行二次发酵。