中温厌氧消化对猪、奶牛粪中腐殖质含量及结构的影响

2020-08-03娄梦函朱燕云李冰青孔祥平葛继文靳红梅

中国沼气 2020年3期

娄梦函，朱燕云，朱宁，李冰青，孔祥平，葛继文，杜静，靳红梅,3,4

(1. 江苏省农业科学院循环农业研究中心，南京 210014； 2. 南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095； 3. 农业农村部种养结合重点实验室，南京 210014； 4.江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心，南京 210095; 5. 南京卫岗乳业有限公司，南京 211102)

我国是畜禽养殖大国，年产粪便总量高达38亿t，但其综合利用率不足60%，严重制约了畜牧业的健康发展[1]。厌氧消化技术是畜禽养殖场粪便处理的重要手段，在规模化生猪和奶牛养殖场应用十分普遍[2-3]。厌氧消化技术不仅能有效降低粪便中的主要污染物，而且产生的沼气可作为清洁能源，厌氧消化残留物(即沼液和沼渣)可作为肥料还田[4-5]，是发展生态循环农业的重要纽带。

畜禽粪便中的腐殖质结构复杂、稳定性强，难以在常规生物处理过程中被降解[6]。研究表明，腐殖质在生物处理过程中基本上不能作为异养微生物的碳源，即使有部分腐殖质被分解，微生物也只是改变了它们的部分结构[7]。目前，国内外对于畜禽粪便中腐殖质转化特性的研究多集中在好氧堆肥方面[8-10]，而厌氧消化对腐殖质含量和特性的影响尚缺乏细致的研究。现有关于厌氧条件下腐殖质转化的研究多集中在市政污水和污泥的处理过程中。例如，郝晓地[7]等研究了腐殖质在污水处理单元的演变，结果发现腐殖酸(Humus, HS)的含量在不断变化的同时各组分之间也存在着相互转化关系，且污水的不同处理方式对富里酸(Fulvic acid, FA)和胡敏酸(Humic acid, HA)的去除效果有所不同。厌氧消化过程中腐殖质不仅难以被生物降解，而且还可能因为腐殖质结构中羧基、酚羟基与水解酶结合而抑制水解过程，最终影响厌氧消化的速率和消化残留物的品质[6]。例如，唐兴[11]等研究发现，腐殖质主要通过静电网捕、共价键、化学平衡等作用方式影响污泥厌氧消化的水解过程。腐殖质中丰富的官能团是重(类)金属及有机污染物在环境中迁移和转化的重要载体[12]，进一步影响生态环境安全和人类健康[13]，一直以来是环境地球化学研究领域的热点[14-15]。

我国每年沼气工程产生的消化残留物数量已超过3亿吨，农田利用是其最主要的消纳途径[4]。阐明厌氧消化条件对畜禽粪便中腐殖质变化特征的影响，对消化残留物还田后的肥效及其环境效应具有重要的意义。我国生猪和奶牛养殖量位居世界第一位和第四位，二者的粪便产生量占我国畜禽养殖粪便排放总量的65%以上[16]，中温厌氧消化工艺是猪、奶牛粪处理中最常用的手段之一。鉴于此，本研究通过室内批次中温35℃±1℃厌氧消化试验，研究了猪、奶牛粪在不同进料浓度条件下消化残留物中HS，FA和HA含量的变化特征，进一步结合傅里叶红外光谱法(FTIR)解析了消化残留物中官能团结构的变化，以期为畜禽粪便沼液和沼渣后续的合理利用及环境风险评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试原料为猪粪和奶牛粪，分别取自本研究团队长期定位监测的规模化生猪养殖场和奶牛养殖场。取样时间分别为2019年3月20日和3月2日，一次性取样后置于0℃～4℃冰箱中保存备用。接种物为监测猪场的发酵罐排出的污泥，在实验室经中温35℃±1℃驯化至甲烷含量占总产气量的55%以上后使用。各物料基本理化性质详见表1。

表1 物料基本理化性质

1.2 试验设计

厌氧消化试验在180 mL血清瓶(有效容积为150 mL)中进行。试验设置5个处理，各处理的物料配比详见表2。接种物接种量设为30%(w∶w)。根据各处理的进料浓度和接种量，分别在血清瓶中加入相应的物料，其余的用蒸馏水作为补充。装料后立即通入高纯氮气(>99.99%)5 min，用以驱赶瓶内空气。通气结束后立即用橡胶塞密封，并放置于恒温水浴锅35℃±1℃中进行试验。每天上午9：00和下午5：00手动摇匀物料两次，随后记录日产气量并测定气体中的CH4含量。试验进行至反应体系中日产气量不足总产气量1%时停止[17]，共计34 d。每个处理设置3个重复(n=3)。

表2 试验处理及物料配比

1.3 取样及分析

1.3.1 取样方法

试验结束后，称量消化残留物质量，并充分混匀后取样。样品分为两部分，一部分用于测定常规指标，另一部分采用真空冷冻干燥机(Alpha1-4/2-4LD Plus，北京五洲东方科技发展有限公司，北京)进行冷冻干燥处理，用于测定腐殖质含量和结构。

1.3.2 测定方法

(1)日产气量和甲烷含量：日产气量采用排水法测定[18]，甲烷含量采用气相色谱仪(GC9890B，南京仁华色谱科技应用开发中心，江苏)测定；

(2)pH值：采用pH计(FE20，梅特勒-托利多仪器有限公司，上海)测定；

(3)TS含量：样品用电热鼓风干燥箱(DHG-9076A, 上海精宏实验设备有限公司，上海)于105℃温度下烘干至恒重，冷却至室温后称重；

(4)VS含量：样品用马弗炉(SRJX-4-13，天津市泰斯特仪器有限公司，天津)于550℃下灼烧3 h，冷却至室温后称重[18]；

(5)TOC和TN含量：参照中华人民共和国农业行业标准《NY525-2012有机肥料》中的方法测定；

(6)腐殖质含量：参照国际腐殖质协会(International Humic Substances Society, IHSS)制定的方法提取，即用NaOH+Na4P2O7提取法提取总腐殖质(HS)，用“碱溶酸析”的方法提取FA和HA[19]。提取液分别采用TOC仪(MultiN/C3100，德国耶拿分析仪器股份公司，德国)测定其中的有机碳含量；

(7)基团组成结构：取1～2 mg冻干固体，利用傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet Is50，赛默飞世尔科技公司，美国)进行红外光谱分析，波数采集范围为4000～400 cm-1。

试验中所用药品均为分析纯。

1.4 数据处理

干物质计算公式为：

m=m0×TS

(1)

式中：m为物料干物质重量,g；m0为物料总质量；TS为总固体含量。

HS回收率计算公式为：

(2)

式中:R为HS的回收率,%；MFA为FA的质量,mg；MHA为HA的质量,mg；MHS为HS的质量,mg。

物料中HS,FA,HA质量(以干重计)计算公式为：

M=C×m

(3)

式中:M为HS或FA或HA的质量,mg；C为HS或FA或HA的浓度,mg·g-1；m为物料干重,g。

红外光谱数据处理采用OMNIC8.2v.软件，首先将透过率转化为吸光度，然后分别进行自动基线校正、纵坐标极差标准归一化，在所得的样品图谱中根据峰面积计算方法，求得各吸收峰面积，以某一特定吸收峰面积与所有红外吸收峰面积的比值表示这一组分的相对含量。

各指标在不同处理间的差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比较采用最小显著性差异法(LSD)，同一处理发酵前后的差异采用独立样本T检验，统计分析软件为SPSS19.0v.，图形绘制软件为Origin9.4v.。

2 结果与讨论

2.1 产气特征

整个中温厌氧消化过程中的日产气量、累积产气量、日产甲烷量与累积产甲烷量变化如图1～图4所示。不同发酵浓度的猪粪和奶牛粪的日产量变化差异明显，即：猪粪最大日产气量出现在9 d以后，且在第12天和第25 天出现第2次产气高峰。这可能是由于猪粪中可溶性有机物含量高，前期被分解产生大量的有机酸导致体系pH值下降，对产甲烷菌有一定的抑制作用，随后微生物通过自身的缓冲调节恢复正常代谢水平[20]；而奶牛粪在发酵4 d内即达到最大日产气量，随后逐渐下降(见图1)。从累积产气量看(见图2)，猪粪处理组显著(p<0.05)高于奶牛粪处理组，发酵浓度高的处理组高于发酵浓度低的处理组。日产甲烷量、累积产甲烷量变化趋势与日产气量、累积产气量基本一致(见图3和图4)。各处理的甲烷含量最终稳定在60%左右，累积产气量达238.0～484.8 mL·g-1VS，这与团队前期利用相同原料进行中温厌氧消化的研究结果基本一致[18,21]，说明本研究反应体系正常，所得的消化残留物具有代表性。

注：平均值±标准误(n=3)，下同。

图2 发酵过程中的累积产气量

图3 发酵过程中日产甲烷量

图4 发酵过程中累积产甲烷量

2.2 干物质质量变化特征

猪粪和奶牛粪中温厌氧消化前后的干物质质量变化如图5所示。产气结束后，各处理的干物质质量均有不同程度的降低，这是由于微生物利用了原料中糖类、蛋白质、氨基酸、脂肪酸等物质作为营养物质，将其转化为CH4，CO2等气体排出发酵体系，最终导致发酵体系中干物质质量降低[22-23]。CK，PM1，PM2，DM1和DM2处理发酵后干物质质量降幅分别为5.3%，31.0%，31.7%，15.4%，17.9%。除CK外，各处理的降幅均达到显著(p<0.01)水平。其中猪粪中温厌氧消化后干物质质量降幅显著(p<0.01)高于奶牛粪，同时，高浓度处理的干物质质量降幅高于低浓度处理。这也与前文所述产气结果相一致，即产气越多的处理组其干物质损失也越多。

注：平均值±标准误(n=3)；不同大、小写字母分别表示发酵前后各处理间差异显著(p<0.05)；ns，**表示同一物料发酵前后无显著性差异和差异显著(p<0.01)，下同。

2.3 腐殖质含量变化特征

根据HS在酸碱性水溶液中的溶解度的不同，可将其分为FA和HA和胡敏素(Humin，HM)。其中，FA既能溶于碱溶液，又可溶于酸溶液；HA可溶于碱溶液，但不能溶于酸溶液；而HM不能溶于酸或碱溶液中，因此不能用酸碱溶液提取[24-25]。由于HM成分复杂、分离纯化较为困难，且其呈惰性几乎不参与反应，因此本试验主要探讨了HS,FA和HA含量的变化特征。为保证试验的准确性，首先对HS的回收率进行计算(详见公式2)。从表3可以看出，利用IHSS方法提取所得HS的回收率在86%～112%，测定结果可靠。

表3 物料腐殖质含量的回收率

中温厌氧消化前后物料中HS,HA和FA的浓度变化如图6～图8所示。中温厌氧消化后，除了DM1和CK处理外，其他处理的消化残留物中HS和FA浓度均显著(p<0.01)降低(图6和图7)，这说明中温厌氧消化会降低物料中HS和FA的浓度，二者被微生物部分降解或转化为HA；猪粪和对照处理中HA浓度均显著(p<0.01)降低，而其在奶牛粪处理中却显著(p<0.01)升高(图8)。这与李琦等人进行的污泥干式厌氧发酵后腐殖酸变化的研究结果相一致[26]，说明厌氧消化体系中微生物分解利用可生物降解的有机质，产生许多中间代谢产物，如糖类、氨基酸和小分子有机酸等，微生物在适宜条件下利用这些代谢产物合成HA(即美拉德反应)，从而造成HA浓度上升[27]。HS,HA和FA的浓度随发酵浓度的增加而增加；猪粪原料中HS,FA浓度显著(p<0.05)高于奶牛粪，这主要与猪粪中腐殖质含量较高有关[28]。

图8 发酵前后物料中HA浓度变化

图7 发酵前后物料中FA浓度变化

图6 发酵前后物料中HS浓度变化

由于中温厌氧消化过程中物料的质量发生变化，因此将腐殖质的浓度换算为质量进行分析(详见公式3)。中温厌氧消化前后物料中HS，HA和FA的总质量变化如图9～图11所示。除奶牛粪中HA质量及对照组FA质量无明显变化之外，其余处理组的腐殖质质量变化总体趋势与浓度变化基本一致，即厌氧消化后HS，FA和HA的质量均有显著(p<0.01)降低，这主要是由于畜禽粪便经厌氧发酵后消化残留物中的干物质含量下降所造成。厌氧消化对FA的去除效果优于HA，主要是由于FA分子量(600～1500 Da)小于HA分子量(10000～100000 Da)，且FA解离程度高而芳香化程度低，同时也说明了HA作为高分子聚合物难以被生物降解的特性[9]。

图11 发酵前后物料HA质量变化

图9 发酵前后物料HS质量变化

2.4 物料组成结构变化特征

基于FTIR分析的中温厌氧消化前后物料基团组成结构的变化特征详见图12。已有研究表明，峰1(3050～3570 cm-1)表征C-OH的伸缩振动，化合物来源主要为多糖、纤维素；峰2(2930～2840cm-1)表征脂肪族、脂质类化合物的C-H伸缩振动吸收；峰3(1650～1630 cm-1)表征芳环的C=C骨架振动吸收、酰胺类物质中的C=O伸缩振动(酰胺Ⅰ带)，多来源于苯环、芳香族化合物[29]；峰4(1664～1515 cm-1)表征酰胺羧基C=O伸缩振动、酰胺类化合物中的N-H弯曲变形(酰胺Ⅱ带)，故将其指定为氨基类化合物、蛋白质类物质；峰5(1410～1380 cm-1)表征酚羟基C-O的伸缩振动峰，可将其归于酚醛类化合物[30]；峰6(1280～1150 cm-1)表征芳香族化合物COOH的伸缩振动，化合物来源多为FA；峰7(1050～1000 cm-1)表征糖类C-O单键的伸缩振动，代表性物质主要为多糖类化合物[31]。中温厌氧消化前后各物料的FTIR图谱形状较为相似，吸收峰个数与吸收峰位置基本不变。这表明猪、奶牛粪中温厌氧消化后，消化残留物的结构组分与官能团种类未发生明显的变化。

图10 发酵前后物料FA质量变化

图12 发酵前后各处理物料的FTIR谱图

中温厌氧消化前后物料中各官能团的相对含量详见表4。结果表明，物料主要由糖类、蛋白质、脂质、酚类等有机化合物组成，其中以多糖类(峰1、峰7)的占比最高，这与前人的文献报道相似[31]。DM2，PM2处理厌氧消化前后各官能团占比的变化幅度高于DM1，PM1处理，说明高浓度条件下厌氧消化反应更为活跃，这与前文中产气情况及干物质质量变化相一致。与原料相比，PM1，PM2处理中多糖类物质占比有所升高，而DM1，DM2处理中多糖类物质占比下降，表明奶牛粪在发酵过程中部分糖类作为营养物质被微生物所利用；DM1，DM2处理中脂肪族、蛋白质类、酚类化合物占比均下降，这是造成其多糖类物质占比增加的主要原因。而DM1，DM2处理中脂肪族、脂质、酚类化合物占比增加，主要是厌氧微生物代谢产物增加造成的；除PM2外，所有处理的芳香类化合物(峰3和峰6)占比均有所升高，可能是由于PM2处理厌氧消化过程最为活跃，使得少量芳香类化合物被微生物分解。综合分析可以看出，厌氧微生物更容易利用脂肪族、酚类、蛋白质等小分子有机物[26,31]。此外，腐殖质中含氧官能团的大量存在会增强氧化还原、络合、离子交换等反应性，最终影响厌氧发酵速率、发酵产品品质及其对土壤改良效果。