基于网络药理学的茵陈五苓散治疗非酒精性脂肪肝病的机制分析＊

欧海亚，叶小鹏，李 舒，刘嘉辉，邝卫红

（1. 广州中医药大学附属宝安中医院 深圳 518133；2. 广东医科大学 湛江 524000；3. 中山大学附属第一医院中医科 广州 510080）

非酒精脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常见的慢性肝脏疾病，影响全世界约25%的成年人[1]，其特征是无大量饮酒和无其他明确的肝损害因素所致的肝实质细胞脂肪变性。近年来，中国NAFLD 患病率逐年上升，并呈现出年轻化的趋势。有研究显示，我国城市地区和农村地区的NAFLD患病率分别为21.83%和20.43%[2]。起初NAFLD 被认为属于良性疾病的一种，但随着对该病不断深入研究发现，NAFLD 具有发展成为肝纤维化的可能性，并且与肝硬化、肝癌、肝衰竭等终末期肝病变密切相关，对公众健康构成严重威胁[3-4]。目前，现代医学对NAFLD发病机制尚不十分明确，治疗措施主要以改变不良的生活习惯和控制代谢因素为主[1]，单一的治疗方法难以取得理想的效果，若盲目进行多药物干预则可能会增加肝脏的负担。因此，寻找一种有效且作用途径多样化的防治方案，对治疗该病以及降低NAFLD引起的肝脏终末期病变发生率具有重要的意义。而基于辩证论治，经过长期临床验证且具有多作用途径优势的中药复方无疑值得进一步深入研究。

茵陈五苓散（Yinchenwuling Decotion，YCWLD）出自《金匮要略·黄疸病脉证并治第十五》，用于治疗黄疸病（湿重于热型），由茵陈、白术、茯苓、桂枝、泽泻、猪苓组成，具有保肝利胆、抗炎、降血脂、改善胰岛素抵抗等作用[5]，临床研究表明，茵陈五苓散具有降低NAFLD 患者的γ-GT、ALT、ALP 及AST 等肝功能异常指标，下调LDL-C、TC 及TG，升高HDL-C 从而调节脂代谢[6]，减轻腹部CT和B超等脂肪肝影像学改变，调节肠道肠杆菌、葡萄球菌数量、拟杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌等肠道菌群的数量进而改善NAFLD 患者的肠道菌群紊乱状态等功能，从多个方面发挥治疗NAFLD的作用[7-8]。

然而，目前研究多局限于某一作用靶点或某一通路来论述其作用机制，无法反映本方多成分、多靶点、多途径的特点，也未能从整体水平来阐述YCWLD 治疗NAFLD 的机制。网络药理学结合了层次网络构建与分析、生物信息学、计算生物学、多向药理学分析等多学科的研究方法和内容，可以从单一靶标、单一途径的研究形式转变为整体、系统的形式探索药物、靶点、疾病之间的关联，与中医的整体观一致，此研究方法融合了生物网络及计算方法与实验方法,为研究复方物质基础以及药物开发提供了思路[9-10]。本研究利用网络药理学的方法，以中药、化合物、疾病靶点为研究对象，对YCWLD 治疗NAFLD 的物质基础及作用机制作了较为系统的分析及预测，为系统开发YCWLD提供科学依据及研究方向。

1 材料与方法

1.1 YCWLD化学成分的收集

从TCMSP（https://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）和Batman-tcm（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）两个中药化学数据库中检索出YCWLD 中六味中药的化学成分。通过TCMSP 数据库对所有分子的名称进行整理，删除重复化合物的化合物，并获取3D 分子结构*.mol2 格式文件。再借助OpenBabe1 2.4.1 软件将分子结构转换为Smiles 结构序列为后续靶点预测做准备。其中TCMSP 数据库收集了《中华人民共和国药典》（2010年版本）注册500种中药，通过文献研究以及整合了TCM@taiwan，TCMD，TCMID 等10 多个中药成分数据库，从而尽可能准确及全面地获得每味中药中的化合物，并经过严格药理学和临床知识审查后收录了30 069 种化合物。此外，该数据库不仅提供了化合物信息参数查询及化合物结构文件下载功能，而且提供了的另外一个独特的核心功能，即通过构建多个数学模型详细地预测了各个化合物的吸收、分布、代谢及排泄（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）等毒药物动力学参数，为化合物地筛选提供了诸多便利，现多应用于中药及复方的网络药理学研究[11]。

1.2 候选化合物的筛选

口服利用度（Oral bioavailability，OB）、类药性（Drug-likeness，DL）两个参数是评估化合物吸收性后送至循环系统程度及成药可能性的重要指标，也是评估口服化合物是否可发展成为药物的重要参数[12-13]。本次研究筛选出符合OB ≥30%、DL ≥0.20 的分子作为候选化合物，其中各个化合物的OB参数采用王永华等[14]建立的Obioavail1.1 系统进行预测，而类药性借助谷本相似性[15]与drugbank 数据库（http://www.drugbank.ca/）中化合物平均分子性质进行比较而获得。

1.3 候选化合物的潜在靶标的收集

将候选化合物Smiles 分子结构序列导入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）中预测靶点，物种参数设置为Homo sapiens，以置信度阈值（Probability）评估预测结果的可靠性，并选取Probability ≥0.6的靶点作为较可靠的预测靶点。将预测靶点与TCMSP数据库收录的靶点取并集从而获得化合物的潜在靶点。本次使用的Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测是基于分子结构与已有配体进行相似性比较，并通过交叉验证分析从而实现靶标的准确预测[16]。而TCMSP中的靶点主要收集自DrugBank数据库（https://www.drugbank.ca），但因仍有众多化合物的靶点待研究，故本次研究采用数据库收录结合预测模式来筛选候选化合物靶点。

1.4 NALFD相关治疗靶点的选择以及靶点信息查询

以“non-alcoholic fatty liver disease”为关键词在Genecards 数据库（http://www.genecards.org/）、Therapeutic Target Database（TTD）数据库（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、CooLGeN 数 据 库（http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/）查找NALFD 的作用靶点。为减少所选靶点假阳性概率，本次研究从三个数据库中选取与疾病相关度（Relevance score）前100 的靶点作为疾病靶点。将疾病靶点与候选化合物潜在靶点取交集，从而获得YCWLD 治疗NALFD 的靶点。通过蛋白信息数据库（universal protein knowledgebase，Uniprot）（www.Uniprot.org）将所有的治疗靶标名称转换成genesymbol，同时利用DisGeNET 数据库（www.disgenet.org/）分析潜在治疗靶点蛋白类型。

1.5 构建草药-候选化合物-作用靶点网络以及蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）

采用cytoscape3.7.1 软件分别构建草药-候选化合物网络、候选化合物-作用靶点网络，然后利用软件中merge 功能模块将两个网络进行合并成，从而构建草药-候选化合物-治疗靶点网络。将治疗靶点的gene symbol导入至string（https://string-db.org）数据库中，设置物种参数为人类从而获得PPI 网络。利用cytoscape中的NetworkAnalyzer 功能计算出各个节点（node）的网络拓扑参数初步评估其重要性。上述两个网络中节点由中药、化合物、靶点构成，网络拓扑参数中的度值（degree）则表示节点连接其他节点的数量，度值越大在网络中调控的枢纽性作用越强，重要性越突出。

1.6 靶点生物功能的注释分析

通过生物学信息注释数据库DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）对PPI 网络中的治疗靶点进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析以及基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，从而探讨治疗靶点参与的生物学功能以及靶点涉及的信号通路，并通过R3.4.1 软件可视化以及对kegg 结果中重要通路进行分析。DAVID 可通过将输入的蛋白或基因列表进行与已有蛋白或基因生物学功能注释相关联，并通过P值评估蛋白列表注释功能的显著性。

2 结果与分析

2.1 YCWLD的候选化学成分

从TCMSP、Batman-tcm 两个数据中检索出YCWLD 化合物分别为439、136 个,删除重复值后，筛选出符合OB ≥30%及DL ≥0.20 的候选化合物共57个，其中茵陈、茯苓、泽泻、猪苓、桂枝、白术分别含有化合物13 个、16 个、9 个、11 个、7 个，猪苓与茯苓有相同化合物2 个，桂枝与茵陈、桂枝与泽泻、桂枝与猪苓各有1个相同化合物，各候选化合物信息详见表1。

2.2 YCWLD治疗NALFD的潜在作用靶点

通过TCMSP 数据库中及Swiss Target Prediction 数据库中分别收集到YCWLD 靶点132 个、186 个，去掉重复值后共收集到286 个靶点。其中茵陈219 个、白术31个、猪苓37个、茯苓64个、桂枝86个，泽泻33个。通过Genecard、CooLGeN、TTD 数据库分别获取1 162靶点，467个靶点，3个靶点，合并三个数据库与疾病关系度（Relevance score）前100 的靶点，共得到疾病靶点317 个；将候选化合物潜在靶点与疾病靶点进行匹配，最终获得34个YCWLD 治疗NALFD 的靶点，各治疗靶点详见表2。

2.3 中药-候选成分-作用靶点网络的构建与分析

根据上述研究结果，借助cytoscape3.7.1 软件将6味中药、57个候选成分及34个潜在作用靶点进行关联并构建中药-候选成分-治疗靶点网络图（图1）。结果表明，57 个候选化合物中可作用于治疗靶点的有24个，可初步认为YCWLD 中治疗NALFD 的有效成分，其他33 个候选化合物与作用靶点匹配得分较低或暂未发现有治疗NAFLD功能。中药中茵陈、茯苓、猪苓、白术、桂枝、泽泻分别含有有效成分13 个、6 个、4 个、2个、2 个、3 个，作用于32、3、2、5、7、4 个靶点，可见茵陈对YCWLD 治疗NAFLD 起到了重要作用；化合物中第6 号化合物（quercetin）、19 号化合物（beta-sitosterol）、20 号化合物（sitosterol）连接治疗靶点数目排前三，分别连接28、7、4 个靶点，可能成为YCWLD 治疗NAFLD的主要活性成分。就靶点而言，DPP4、NR1H3、NR1H2、SREBF1、SREBF2 的度值排前五，分别连接13、9、9、3、3 个化合物，这些靶点可被多个活性成分刺激是YCWLD 治疗NAFLD 主要作用靶点。从图1可看出，草药、化合物、靶点之间构成了复杂关系网络，一种化合物对应多种靶点，一种靶点可以受到多种化合物刺激，体现了YCWLD多成分多靶点的治疗特点。

2.4 PPI网络的构建与分析

将34 个作用靶点导入至string 数据库中，设置organism：Homo sapeins，节点之间的置信度（Combine score）设置为high confidence（0.700）获取结果后导入cytoscape 中构建PPI网络图，详见图2。图中节点表示靶点，边表示蛋白之间的作用关系，网络中有34 个节点（其中2 个靶点不连接其他蛋白），126 条边，度值前六的蛋白为IL6、TNF、AKT1、IL1B、CCL2、ICAM1，分别连接19、18、15、14、14、14 个蛋白，这些蛋白与其他作用靶点关联密切，在整个调节网络中起到枢纽的作用，可能成为YCWLD治疗NAFLD的关键靶点。

2.5 治疗靶点类型分析结果

从DisGenet 数据库依次检索各个作用靶点，获得蛋白分类信息并进行频数统计，详情见图3，从图中可知YCWLD 治疗NALFD 过程中以转录因子、核酸结合、受体、酶（水解酶、蛋白酶、氧化还原酶、激酶、转移酶等）、信号分子、酶调节剂、钙结合蛋白、细胞骨架蛋白、载体蛋白等靶点类型为主。

表2 治疗靶点的基本信息

图1 草药-候选化合物-治疗靶点网路图

2.6 GO分析以及KEGG通路富集分析结果

图2 治疗靶点的PPI网络

图3 治疗靶点的分类信息

本研究中将34 个治疗靶点导入DAVID 数据库中进行GO 富集分析以及KEGG 通路分析，GO 分析从分子功能（Molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）和细胞组分（cellular component，CC）三个层面分析了各靶点的功能分布。其中BP 分析中符合P＜0.01的条目有137个，其中富集靶点数前三的分别为positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter、transcription，DNA-templated、inflammatory response，详见图4-A；CC分析获得具有显著性意义（P＜0.01）的条目6 个，详见图4-B。MF 分析中获得P＜0.01 的 条 目15 个，protein binding、transcription factor activity,sequence-specific DNA binding、Acytokine activity、sequence-specific DNA binding 作用突出，详见图4-C。KEGG 分析提示作用靶点涉及43 条信号通路，与NAFLD 可能有关且P＜0.01 的通路有17 条，其中NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 这三条通路富集靶点数排前三位，并提示这三条通路可能作为YCWLD 治疗NAFLD 的重要通路值得进一步探讨。此外，图4-D 结果显示，通路分析中免疫、炎症、及物质代谢、凋亡相关通路同样富集较多靶点，提示调节免疫、抗炎作用、促进物质代谢、减少干细胞凋亡可能是YCWLD 治疗NALFD 的重要药效机制之一。

图4 GO与KEGG 富集分析结果

2.7 NAFLD信号通路分析结果

根据KEGG 分析结果显示，聚集靶点最多的为NAFLD 通路，通过R 软件获该取通路图，并用颜色标注作用靶点的化合物数量，如图5 所示，图中NAFLD通路通过TNF 信号通路、糖尿病信号通路、脂肪细胞因子信号通路、PPAR 信号等子通路，发挥改善脂肪性肝炎症、减少脂肪酸合成、改善胰岛素抵抗、调节肝细胞坏死及凋亡的作用。由此可知，非酒精性脂肪肝病的发病具有多种病因，而YCWLD 通过多种机制对NAFLD 发挥治疗作用。各子通路中胰岛素信号通路因靶点可被多种候选化合物可作用，在YCWLD 治疗NAFLD 过程中占有重要意义，可作为候选子通路进一步分析。就草药而言，茯苓、猪苓、桂枝、茵陈、白术、泽泻分别含有4、4、2、2、1、1 个化合物可作用于NAFLD 通路，茯苓、猪苓含可作用NAFEL 通路单体较多，提示此二种草药的增减可能对YCWLD 有效成分配比影响较大，可为临床或者后续实验验证中提供借鉴。

3 讨论

YCWLD 对NALFD 治疗效果确切，但其作用机制尚不明确，目前研究模式多局限于单一靶点或单一生物途径，难以系统的评估其作用机制。应用网络药理学的研究方法可构建多种物质、多个层次相互作用的复杂网络，能系统地阐述分子之间的关系及复方整体治疗效果。此外，也可对单个功能分子进行预测定位及效果评估，对新药研发具有指导作用[17]。这种研究方式与中医强调的整体观及个体化的辩证施药理念基本一致。故本研究借助此种方法较为系统地预测了YCWLD对NALFD的作用机制。

图5 YCWLD调控NALFD通路示意图

中药及复方化学成分多样，在体内的代谢过程更加复杂，本次研究将YCWLD 的整体作用量化为多种候选成分的协同作用，借助TCMSP、batman-tcm 两个数据库较为全面的检索出了YCWLD 中类药性大且通过口服吸收入血较佳的56种成分，对全面预测本方作用机制具有重要意义。然后构建了中药-化合物-靶点网络以及PPI网络，形象直观的展示出YCWLD调控机制错综复杂的作用关系网络，复杂的网络结构提示YCWLD发挥治疗NALFD的作用是通多成分、多靶点、多机制的形式来实现的。就化合物而言，24个候选化合物能匹配到治疗靶点可能成为YCWLD治疗NALFD的有效成分，其中quercetin、beta-sitosterol、sitosterol在化合物靶点网络中可连接多个治疗靶点，提示其潜在作用广泛具有较好的活性可能是调控网络的关键成分。有研究表明quercetin、beta-sitosterol、sitosterol 这三种物质均具有减少NAFLD的肝脏中脂质积累，调节脂质代谢的作用，除此之外，quercetin还具备改善胰岛素抵抗的功能，而Sitosterol 则已被验证可减轻脂肪肝导致的炎症[18-20]。由此可知网络中值较高的化合物治疗NAFLD的作用与文献报道基本一致，提示网络中候选成分具有一定的可靠性，可为进一步研究YCWLD治疗NALFD的药效物质提供新的思路及方向。

本研究中候选化合物的靶点，采用预测结合数据库检索两种方式获得，并与TTD、CooLGeN、GeneCards数据库中的NALFD 靶点进行交叉映射，最终获得YCWLD 治疗NALFD 的34 个靶点。PPI网络表明这些靶蛋白之间非单独产生作用而是存在复杂交错的相互作关系；而靶点分类结果则显示靶蛋白由转录因子、核酸结合、受体、酶、信号分子、酶调节因子等多种类型组成。多类型靶点相互协调及靶点间的连通性与中医的“同病异治”的理念相似，也可能是YCWLD治疗NALFD 疗效加强的机制之一。就靶点而言，中药-候选化合物-作用靶点网络中度值较高的靶点意味着可能被多种候选化合物刺激而产生作用，PPI 网络中的高度值的靶点则代表具有更好的连通性对整个调控网络至关重要[21]，因此两个网络中的高度值靶点可能在YCWLD 治疗NALFD 过程中发挥着核心的作用，值得研究人员重点关注。就候选化合-作用靶点网络中的靶点而言，DPP4 度值最高，已被证明与胰岛素抵抗、NAFLD 以及肝硬化的发生率密切相关[22-23]，经典DPP4 抑制剂如阿格列汀除了可调节血糖改善代谢紊乱外，还可缓解肝脏脂肪变性、保护肝功能、抑制肝星状细胞（HSC）激活、有助于肝纤维化的缓解[24]。而另外两种高度值靶点肝X 受体α（LXRα，NR1H3）和肝X 受体β（LXRβ，NR1H3）均属于II 类核受体的转录因子，可以通过调控SREBP1 来影响脂质合成[25]，同时也可以驱动参与肝脏脂质稳态的基因表达，是预防和治疗非酒精性脂肪性肝病的重要靶点[26]。有研究进一步表明，当脂肪肝发展到到更具破坏性的炎症和纤维化阶段，NR1H3 也是新型抗炎或抗纤维化的靶标之一[27-28]。此外，靶点中PPARs 的三个亚型PPARA、PPARD、PPARG 虽连接化合物较少，但均已被证明在减少肝脏脂质积聚、缓解炎症反应、改善解胰岛素抵抗等方面具有重要调节的作用，目前已有多种药物应用于临床[29-31]。PPI 网络中其枢纽作用较强的靶点与免疫及炎症密切相关，其中炎症是非酒精性脂肪性肝炎的突出标志，肝细胞中的炎症导致促炎细胞因子的释放和细胞凋亡的增加，可被视为NAFLD进展的驱动力[32]。免疫细胞的激活同样会引发肝细胞凋亡，导致组织损伤为晚期纤维化和肝硬化奠定基础[33]。因此，探索炎症和免疫相关靶点可以提高对NAFLD 潜在机制的理解，并有助于新疗法的开发。上述研究结果表明，本次研究预测的多个核心靶点已被证明具有调控NAFLD 的作用，网络中其余高度值靶点具有进一步深入研究的价值。

NAFLD 是一种复杂疾病，脂类聚集、炎症是其发病及进展的两个重要步骤，也是“二次打击”学说的两个重要环节，因此减少肝脏脂肪积累及减轻炎症是治疗NAFLD的关键。本研究中功能富集分析结果显示，NAFLD 的治疗靶点主要参与调节转录、翻译及炎症等生物学过程。这些过程具有改善代谢，促进组织修复及减轻炎症反应的作用，可从多个方面参与NAFLD病变组织的修复过程，与NAFLD发病机制相吻合。基于KEGG 通路分析显示NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 富集治疗靶点数较多，提示这三条通路是YCWLD 治疗NAFLD 过程中发挥重要作用。其中NAFLD 通路是以疾病直接命名的通路且涵盖了TNF、insulin 等多条子通路，体现了NAFLD发病机制的复杂性，也揭示了单一的药物难以达到理想的治疗效果的可能原因。相较而言，YCWLD 在多个子通路中均有治疗靶点，提示此复方多机制调控的优越性且具有巨大潜在研究价值；其余两条通路也与有NAFLD 发病以及进展密切相关，其中Cytokinecytokine receptor interaction 与慢性炎症密切相关，而Insulin resistance 则可导致脂肪细胞中脂解作用受损以及机体过多的向肝脏输送游离脂肪酸从而造成肝脏脂肪的积累[34]。由此推测YCWLD 可通过调控此二条通路可减少NAFLD“二次打击”的形成。此外通路分析结果中Mark、Toll-like receptor、NOD、HIF-1 也均已被证明与NAFLD 密切相关[35-38]，且均富集有较多YCWLD 的治疗靶点，提示YCWLD 可能通过调控这些通路进而干预NAFLD炎症和免疫、代谢稳态、脂毒性、肝细胞死亡等发病及进展机制。

综上所述，本次研究通过网络药理学的方法构建了中药-候选化合物-作用靶点网络，其中包含6 味中药、24个候选成分及34个潜在作用靶点。通过分析发现quercetin、beta-sitosterol、sitosterol 可 能 是YCWLD发挥抗NAFLD 作用的关键成分，DPP4、NR1H3、NR1H2、SREBF1、SREBF2 在众多靶点中作用较为突出。调控NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 等潜在信号通路从而干预炎症和免疫、代谢稳态、脂毒性、肝细胞死亡等机制可能是YCWLD发挥预防及治疗NAFLD的作用的关键。本研究系统的预测及分析了TCWLD 治疗NAFLD 的机制，为进一步实验研究YCWLD 抗NAFLD 的关键化合物、靶点、通路提供了方向。然而，本次研究仅以各节点关系的数量评估其重要性而并未顾及关系的强度，故此次预测的关键节点有一定的偏差。同时在评估YCWLD 的整体作用时，仅考虑各中药中单体叠加作用，未考虑草药剂量、煎煮过程各候选化合物的化学反应、以及候选化合是否存在相互干扰吸收等问题，因此本次研究结果仍需进一步实验进行验证。