真武汤治疗肾纤维化的药效物质基础及分子作用机制研究＊

张怡萍，王 倩，肖 雪，严诗楷，邓远辉＊＊，李莎莎＊＊

（1. 广州中医药大学第二临床医学院 广州 510006；2. 广东药科大学中医药研究院 广州 510006；3. 上海交通大学药学院 上海 200240）

肾脏纤维化是肾脏在一系列致病因子的刺激下由肾脏固有细胞受损发展成为功能逐步丧失的渐进过程，肾间质纤维化、肾小球萎缩及肾小管硬化为肾纤维化主要的病理特征[1]。由于肾纤维化为各种慢性肾脏疾病（Chronic Kidney Disease, CKD）最终进展为肾功能障碍甚至尿毒症的共同病理演变途径，因此在慢性肾脏病的发病过程中，肾纤维化是不容忽视的一个重要病理过程。目前研究表明肾纤维化发病过程复杂且与诸多因素有关，涉及到炎症因子调控（促纤维化因子、抑纤维化因子）、细胞外基质（ECM）合成及积累、氧化应激等多个环节[2-4]，临床上肾纤维化疾病尚无法治愈，因此有必要对肾纤维化的发病机制进行深入探究以期为该病的临床诊断及治疗提供新的思路。

真武汤出自于《伤寒论》中的经典名方，由生姜、炮附子、茯苓、白芍、白术五味药组成，具有温阳利水的功效[5]。临床上真武汤加减常用于治疗肾脏相关的各种疾病中，如糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、肾病综合征、急性肾衰竭等，患者经真武汤治疗后其临床症状、免疫功能得到明显的改善，且药物的安全性高[6]。课题组前期药理实验表明真武汤有明显改善肾纤维化、延缓病情发展的功能[7-9]，但由于药味组成复杂，化学成分较多，对于真武汤治疗肾纤维化的活性成分及潜在作用机制还需进一步深入探索。

网络药理学是基于系统生物学理论，主要以文献为基础，同时结合多种组学、高通量数据分析、网络分析及虚拟计算等技术，通过构建“药物-成分-疾病-靶点”之间复杂的网络关系，阐明疾病的发生发展过程、药物药效物质基础及作用机制。由于网络药理学具有系统性及整体性的特点，与中药及其组方制剂的多成分、多靶点、多途径、多层次的作用特点相似，在防治复杂疾病方面具有独特的优势[10]。因此本文主要通过网络药理学的方法分析真武汤的药效活性成分及潜在作用靶点，深入阐明真武汤治疗肾纤维化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 真武汤活性成分的筛选

采用中药系统药理学分析平台（TCMSP，http//lsp.nwu.edu.cn./tcmsp.php）对真武汤各单味药附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata）、茯苓（Poria Cocos Wolf）、生 姜（Zingiber Officinale Roscoe）、白 术（Atractylodes Macrocephala Koidz）、白 芍（Paeoniae Radix Alba）进行检索，获得真武汤的主要化学成分，以成分的口服生物利用度（OB）和类药性（DL）作为筛选条件对各味药的化学成分进行筛选，选取OB ＞30%和DL ＞0.18 的成分为真武汤治疗肾纤维化的主要活性成分。

1.2 药效成分靶点预测

采用TCMSP 数据库获得筛选后药效成分的靶蛋白，将筛选得到的靶蛋白英文名输入到蛋白质数据库（uniprot）中，收集对应的靶点基因；同时利用pubmed数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）获得真武汤活性成分相应的典型SMILES 结构，将获得的SMILES 结构导 入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库中，利用平台反向药效团匹配方法得到虚拟筛选结果，收集相关靶点基因，将上述两种方式合并去除重复靶点建立药效活性成分靶标库。

1.3 肾纤维化靶点的筛选

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，以肾纤维化（renal fibrosis）为关键词进行搜索，得到与肾纤维化相关的基因，作为疾病的候选靶点基因。

1.4 网络的构建

将上述真武汤药效成分、成分作用的靶点及疾病作用靶点的PPI 网络导入Cytoscape 3.5.0 软件进行可视化分析，结果共得到四个网络：“活性成分-作用靶点”网络、“活性成分-疾病共有靶点PPI”网络、“成分-疾病-靶点-通路”网络、“核心成分-疾病-核心靶点-通路”网络，活性成分、作用靶点及潜在作用通路用不同颜色的节点（node）表示。若某一靶点为某化合物的潜在作用靶点，则以边（edge）相连，通过构建网络研究真武汤治疗肾纤维化多成分、多靶点、多通路的作用。

1.5 靶点通路注释分析

取活性成分靶标与疾病靶标的交集基因，利用软件中的clugo 插件对获取的靶点信息进行基因本体论信息资源数据库（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，通过设定阈值P＜0.01 选取具有显著性差异的所有通路，筛选靠前的几条通路通过KEGG（https://www.kegg.jp/）数据库进行整合并绘制最终的通路图。

2 结果

2.1 真武汤药效成分筛选

本研究利用TCMSP 数据库根据口服生物利用度和类药性作为筛选标准共得到真武汤候选药效成分61 种，其中附子21 种，茯苓15 种，白芍13 种，白术7种，生姜5 种，经剔除未筛查到靶点的成分，最终获得药效成分43 种，其中β-谷甾醇是附子和白芍的共有成分，表1为成分筛选后的结果。

2.2 真武汤化学成分靶点预测

在TCMSP 数据库中筛查药效成分及药效成分的靶蛋白，将筛选得到的靶蛋白英文名输入到Uniprot数据库中，得到成分靶点基因；另外将TCMSP 数据库中筛查到的药效成分采用Pubchem 数据库搜索SMILES号，在Swiss Target Prediction 中输入SMILES 号，物种选择“Homo sapiens”，找到相应的靶点基因。将这两种方法筛选到的成分取并集，删除两者共同的成分靶点，筛选出257个药效成分的靶点，得到成分靶点关系767对。

2.3 活性成分-肾纤维化共有靶点的筛选

以“renal fibrosis”为关键词在GeneCards 数据库中进行检索，结果得到与肾纤维化相关的靶点基因3995个，选取Score 值前1000 个基因导入https://string-db.org/网站中，得到肾纤维化靶点PPI 网络图，将肾纤维化靶点的相互作用网络导入Cytoscap 3.5.0 中，在Cytoscap 3.5.0 中将活性成分-作用靶点网络和肾纤维

化靶点的相互作用网络利用merge 功能进行合并，得到66个活性成分与疾病的共有靶点。

表1 真武汤药效成分筛选结果

2.4 网络构建结果

2.4.1 真武汤活性成分-作用靶点网络构建

利用Cytoscape 3.5.0 软件构建真武汤“活性成分-作用靶点”网络如图1-A 所示。该网络共包含300 个节点，766 条边，其中药效成分有43 个节点，与药效成分相关的靶点基因有257个节点。

2.4.2 活性成分-疾病共有靶点PPI网络构建

采用Cytoscape 3.5.0软件对66个与肾纤维化相关的靶点基因进行网络构建可视化分析。如图1-B 所示，活性成分-疾病共有靶点PPI 网络图总共包括65个节点，546 条边（其中1 个节点与其他节点无相互作用关系）。

2.4.3 成分-疾病-靶点-通路相互作用网络

将获得到的66 个与肾纤维化相关联的潜在作用靶点，利用Cytoscap 3.5.0 中的Cluego 插件对靶点基因生物学过程及代谢通路进行富集分析。设置P＜0.01表示具有非常显著性差异的代谢通路，结果得到真武汤活性成分43 个，共同的靶点66 个，参与的关键通路19 条，如图1-C 所示。在网络图中，每个节点的大小和其Degree（度）值大小相关，节点越大颜色越深代表该节点在网络中起关键作用。在“成分-疾病-靶点-通路”网络图中有23个靶点未富集到相关的肾纤维化代谢通路，在图中采用白色圆圈显示，处于网络中心的靶点蛋白TNF、AKT1、MAPK8 为参与通路数量大于10 的三个靶蛋白，其他疾病靶点根据靶点的Degree 值是否大于所有靶点的平均值则用不同大小呈现。

2.4.4 核心成分-疾病-核心靶点-通路相互作用网络

以能够聚集到通路的43 个靶点为核心靶点，剔除无核心靶点的成分，结果33 个核心成分能够作用于43 个核心靶点，参与的关键通路19 条，如图1-D 所示。以Degree 值大于所有靶点平均值的靶点为关键核 心 靶点，TNF、AKT1、MAPK8、IL6、CASP3、JUN、

BCL2、TGFB1、PRKCB、BAX、CASP8、INSR、PTGS2、ICAM1、SELE、VCAM1、NOS3、STAT1 等18 个靶点位于网络中心，为真武汤治疗肾纤维化的重要靶点。33 个核心成分作用的关键靶点及关键核心靶点，如表2 所示。

2.5 真武汤治疗肾纤维化活性成分潜在靶点的通路注释

在GO 功能富集分析过程中，共确定了101 个GO条目，其中有10 条关于分子功能，主要涉及类固醇激素受体活性、胰岛素受体结合、过氧化物酶的活性、氧化还原酶的活性、ATP 酶的活性等方面；91 条关于生物学过程，主要涉及活性氧（ROS）代谢过程的调控、白细胞介素-6（IL-6）产生的调控、氧化应激反应的调控、血管内皮生长因子（VEGF）产生的调控、一氧化氮（NO）生物合成的调控等方面。

在KEGG 通路富集分析中，共得到19 条相关通路。将通路按照P 值从小到大进行排序，得到真武汤治疗肾纤维化的潜在通路，如表3 所示，其中AGERAGE 信 号 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、胰岛素抵抗信号通路（Insulin resistance）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、剪切应力和动脉粥样硬化信号通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、Toxoplasmosis信号通路、乙型肝炎信号通路（Hepatitis B）、非酒精性脂肪肝信号通路（Non-alcoholic fatty liver disease）为真武汤治疗肾纤维化的重要信号通路。

2.6 真武汤治疗肾纤维化通路分析

将治疗肾纤维化的关键核心靶点与前三条通路通过KEGG 数据库进行通路注释分析，并进行整合绘制最终的通路图（如图2）。通路中的靶点为蓝色长方形标记，真武汤治疗肾纤维化的靶点为紫色椭圆标记，由图中可以看出AGE-RAGE信号通路为主要的信号通路，该通路与多个通路相关，并且多个靶点直接/间接地通过该通路发挥治疗肾纤维化的作用，同时

Insulin resistance signaling pathway、TNF signaling pathway、 PI3K-AKT signaling pathway、 TGF- β signaling pathway 及其他信号通路共同参与肾纤维化的过程，为真武汤治疗肾纤维化的重要信号通路。

3 讨论

3.1 真武汤核心成分-关键核心靶点探讨

图1 网络互作图

由表2可知山奈酚、β-谷甾醇、得尔妥因、豆甾醇、儿茶素、芍药吉酮、茯苓酸、水黄皮素、3β-乙酰氧基苍术酮、麦角甾醇过氧化物、6-甲基姜二醇双乙酸、芍药苷等活性成分均可作用于关键核心靶点，其中山奈酚、β-谷甾醇对应的关键核心靶点最多，分别为13 个和6个。山奈酚为白芍中的黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[11]，有研究表明在糖尿病肾病大鼠中，山奈酚能够降低大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，同时降低caspase-3、caspase-9、NLRP3、ASC 和caspase-1 及炎症因子IL-18 和IL-1β的表达水平，对肾功能和组织病理损伤具有保护作用[12]。β-谷甾醇为来源于白芍和附子中的三萜类成分，具有降脂、抗氧化、免疫调解等作用，Loizou 等[13]研究表明β-谷甾醇能够抑制血管内皮细胞粘附分子1（VCAM-1）和细胞间粘附分子1（ICAM-1）表达，减弱NF-kB p65 磷酸化，提示β-谷甾醇有抗内皮细胞炎症的作用，同时β-谷甾醇葡萄糖苷也有强的抑制TNFα、IL-1β和IL-6炎症因子作用。芍药苷对应的关键核心靶点为TNF、IL6，TNF、IL6 为肾纤维化发生关键炎性细胞因子，在促进细胞外基质（ECM）积聚及在加速肾小球硬化进展中起重要作用[14]，表明芍药苷能直接参与治疗肾纤维化的过程。来自茯苓中的茯苓酸和麦角甾醇过氧化物主要作用于NOS3 等疾病靶点，NOS3 为内皮性一氧化氮合酶基因，主要功能是参与精氨酸和脯氨酸代谢，并催化生成一氧化氮（NO），NO具有调节血管张力和影响内皮功能，肾组织各个部位的固有细胞均能分泌NO，肾固有细胞NO 分泌不足可引起细胞损伤及内皮功能障碍，因此NO 的释放在维持肾脏正常生理功能中具有重要意义[15]。其他成分可作用的关键核心靶点较少，但都能作用于同一个疾病靶点PTGS2，PTGS2 为前列腺素内过氧化物合酶2，在外部环境的刺激下，肾固有细胞中PTGS2 的表达上调，催化花生四烯酸类物质，通过环氧酶的作用产生多种前列腺素，调节机体炎症反应，发挥抗纤维化的作用[16]，表明真武汤的多数成分可以通过PTGS2 靶点调控肾纤维化过程。

表2 核心成分-核心靶点

由成分-关键靶点探讨得知：白芍中的山奈酚、儿茶素、芍药苷及茯苓中的茯苓酸和麦角甾醇过氧化物

等成分为真武汤中治疗肾纤维化的主要活性成分，其中，白芍中的山奈酚、儿茶素、茯苓酸所对应的靶点TNF、AKT1、MAPK8、IL6、CASP3、JUN、TGFβ1 等均被证实与肾纤维化发展密切相关[17-21]，现代药理研究表明白芍具有免疫抑制样作用，而肾脏疾病多以免疫因素为驱动因素，因此白芍应用于治疗肾脏疾病具有充分的理论依据，另外其他成分可通过NOS3、PTGS2 或其他靶点共同治疗肾纤维化。

表3 真武汤治疗肾纤维化潜在靶点的通路

图2 KEGG通路富集分析图

3.2 靶点GO功能分析

GO 分析结果表明，核心靶点主要涉及类固醇激素受体活性、胰岛素受体活性、过氧化物酶的活性、氧化还原酶的活性、ATP 酶的活性等分子功能，涉及氧化应激反应的调控、活性氧代谢过程的调控、白细胞介素-6 产生的调控、血管内皮生长因子产生的调控、一氧化氮生物合成的调控等生物过程，提示真武汤治疗肾纤维化与胰岛素受体活性、能量代谢、氧化应激及调节肾纤维化相关因子表达的水平有关。西医认为糖尿病为导致肾脏疾病的重要因素，因此糖尿病肾病患者通过注射胰岛素可使肾小球肥大得到缓解，同时能减少患者尿微量白蛋白的含量，降低肾小球滤过率，改善疾病进程[1]。氧化应激会导致活性氧（ROS）的产生，在肾纤维化的发生和发展中ROS 的浓度对调节着机体细胞的增殖、分化起着至关重要的作用，前期实验[22]表明真武汤能使肾纤维化大鼠血清中谷胱甘肽（GSH）及肾脏中ROS 的水平恢复正常，超氧化物歧化酶（T-SOD）活性增加且维持在较高水平，同时可以提高乳酸脱氢酶（LDH）、ATP 及线粒体功能相关的酶的活性，尤其是对有氧呼吸具有整体调节作用，表明真武汤可通过缓解体内氧化应激反应、增加能量代谢治疗肾纤维化，进一步证实了研究结果的准确性。

3.3 KEGG通路分析

AGE-RAGE 信号通路的激活与肾纤维化发病密切相关，该通路中与肾纤维化相关的靶点数量最多有16 个并且与多条通路协同调控肾纤维化进程，广泛参与细胞凋亡、血管生成及炎症反应等。AGEs 为晚期糖基化终末产物，RAGE 为晚期糖基化终末产物受体，AGE 与RAGE 蛋白相互结合可以激活PI3K/Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶）信号通路，PI3K/Akt 信号通路在调节细胞功能方面起着重要作用[23]，PI3K可与其下游分子Akt结合释放大量的炎性介质如TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1，产生炎症反应加速肾纤维化进程。钟利平等[24]在研究抗纤灵方对PI3K/AKT/mTOR 信号通路的影响，发现抗纤灵方能够改善模型小鼠24 h 尿蛋白、尿素氮、血肌酐含量，其机制与抑制PI3K/AKT/m TOR 信号通路表达相关。同时AGE与RAGE蛋白结合后可作用于细胞内的还原型辅酶Ⅱ（NADPH），在生物体的酶促反应中NADPH 可作为还原剂参与多种合成代谢反应，并起到传递氢体的作用，NADPH在NADPH氧化酶的作用下产生ROS，肝脏中的血管紧张素原（AGT）被ROS 裂解形成血管紧张素I（AngI），AngI 继而被ACE 加工处理生成AngⅡ，AngⅡ在细胞质膜上都含有的G 蛋白偶联受体—AT1R 介导下激活TGF-β信号通路，其中TGF-β1是肾纤维化的关键炎性因子，其促纤维化作用主要通过下游Smads 家族传递信号，TGF-β1 上调可通过TGF-β1/Smad 信号通路使ECM 过度积聚，从而导致肾脏纤维化的发生。

肿瘤坏死因子（TNF-α）主要由单核巨噬细胞和活化的T细胞产生的一类具有重要生物活性的炎症细胞因子，也可由肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞产生，TNF-α与1 型 受 体（TNFR1 又 称 作p60，p55，CD120a）在胞外区结合，使TNFR1 形成一个三聚体，三聚体的TNFR1 在细胞内聚集招募下游传导蛋白（TRADD、TRAF2/5、RIPI），下游传导蛋白形成LKK 激酶复合体，激活转录因子NF-kB，活化的NF-kB 和抑制因子IkB-β结合能够诱导或激活TNF-α和IL-6 的产生，进一步扩大炎症反应，激活NF-kB 通路诱导下游的CASP8 以及其他效应分子CASP3/CASP8，产生级联激活反应，最终引起靶细胞凋亡。同时TNF 与2 型受体（TNFR2，又称作p80，p75，CD120b）结合，通过TRAF 家族成员相关的NF-kB 激活剂介导PI3K-Akt信号通路促进肾脏纤维化发生。

肾脏是胰岛素的靶器官，含有丰富的胰岛素受体，包括肾小球足细胞、内皮细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞和集合管上皮细胞在内的肾固有细胞，均对作为效应细胞的胰岛素高度敏感，这些细胞的结构和功能异常与胰岛素及其受体活性密切相关[25]，胰岛素抵抗是慢性肾脏病进展的机制之一，文献报道足细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在调节肾小球滤过的功能上发挥重要作用，而胰岛素可调节VEGF 在肾脏中的表达，表明Insulin resistance 信号通路在为真武汤治疗肾纤维化的重要通 路[26]。 其 他 信 号 通 路 如Fluid shear stress and atherosclerosis、Toxoplasmosis、Non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）等参与肾纤维化相关的靶点较多，提示其在肾纤维化的发生、发展过程可能发挥重要作用。

本研究通过网络药理学方法系统的对真武汤治疗肾纤维化的主要成分、潜在靶点及作用机制进行研究，表明真武汤中山奈酚、β-谷甾醇、芍药苷、茯苓酸、麦角甾醇过氧化物等成分为真武汤的主要药效成分，其发挥抗纤维化的作用主要通过TNF、AKT1、

MAPK8、IL6、CASP3、JUN、BCL2、TGFB1、CASP8、ICAM1、NOS3 等关键核心靶点参与AGE-RAGE 信号通路、Insulin resistance 信号通路、TNF-α信号通路及其他相关联的信号通路如NF-kappa B 信号通路、TGF-β信号通路通过调节胰岛素受体活性、氧化应激和纤维化因子的表达水平干预疾病。本研究采用网络药理学的方法对真武汤治疗肾纤维化的有效成分、作用靶点及相关通路进行初步探索，可为后期真武汤治疗肾纤维化作用机制深入研究提供参考。尽管网络药理学的系统性与整体性思想与中药的多成分、多靶点、多通路的特点殊途同归，但尚不能完全的揭示成分-靶点-通路的作用特点，并且本研究的药效成分是基于已有的数据库进行预测，因此研究所得的结果还需在体内外实验进行相关验证。