基于网络药理学的忍冬藤抗类风湿关节炎作用机制研究＊

郭思琦，姜春燕，张百霞＊＊

（1. 河北大学中医学院 保定 071002；2. 中国药科大学中药学院 南京 211198）

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种病因未明的以滑膜炎和血管翳为主、以对称性关节炎为主要临床表现的异质性、系统性的慢性自身免疫功能障碍性疾病[1]。RA 在我国发病率约为0.32%-0.37%，多见于中年女性[2]。RA 不但影响身体的运动系统，还会累及心脏、肾脏、呼吸等系统，严重影响人们的正常生活和工作[3]。

根据RA 的临床表现，中医将其归为“痹症”。痹症主要由于风寒湿等邪毒侵入，引起经络阻塞，气血不畅所致。藤类药物有通经入络功效，常用于临床治疗多种风寒湿痹。忍冬藤为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥茎枝，味甘、寒，归肺、胃经，具有清热解毒，疏风通络的功效[4]。《本草纲目》记载忍冬藤“治一切风湿气及诸肿痛”，《履巉岩本草》记载忍冬藤“治筋骨疼痛”。现代数据统计和挖掘分析表明，忍冬藤为医家治疗RA 的常用药物。如分别对国医大师刘祖贻[5]、马文辉[6]、王庆国教授[7]治疗RA 临床经验数据进行统计分析，发现三位医家治疗RA 的高频次药味均包含忍冬藤。现代药理学研究表明，忍冬藤被广泛应用于风湿、类风湿和痛风等疾病的治疗[8-10]。

网络药理学，是从生物网络的角度研究疾病的发生发展过程、认识药物与机体的相互作用，并指导新药发现的学科[11-12]。其基本思想是研究疾病状态下的生物网络，而非与疾病相关的个别基因或蛋白，从而达到综合的防治效果。网络药理学方法能够从中药调控的整体生物网络层面进行分析，融合了海量的生物学和中医药领域的数据和技术，并利用网络分析技术，同时具有快速高效的特点，因此该方法被越来越广泛的应用到中药作用机理解析中[13-15]。目前，利用网络药理学探讨RA 的发病机制已有大量研究，但忍冬藤治疗RA 的作用机制还未见系统解析与报道。本研究基于实体语法系统，构建忍冬藤治疗RA 的生物网络，以推断化学成分作用靶点与RA 相关靶点蛋白的作用关系，从而辨识忍冬藤治疗RA 的有效成分，解析忍冬藤治疗RA的作用机制。

1 数据与方法

1.1 数据来源

忍冬藤的化学成分数据：来源于TCMSP 数据库和TCMD 数据库，以药代动力学（ADME）参数确定药物口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18为筛选条件，筛选化学成分。并利用CNKI 和PubMed 中的文献（1979-2019 年）进行补充。利用Chemical Book、爱化学数据库对所得化学成分名称进行规范，共得到化学成分54个。

化学成分作用靶点蛋白数据：来源于Stitch 5.0（http://stitch.embl.de./），以化学成分名称为检索条件，置信度为0.400，数据来源于文本挖掘、共表达、基因融合等8种方法。

RA 相关靶点数据：来源于GAD 数据库，共得到185个疾病靶点。

生物学反应及信号通路数据：来源于Reactome 数据库（http://www.reactome.org）。Reactome 包含了人类的6792 个复合物、7327 个蛋白质，共1522 个生物学反应、7075 个反应以及各种生物分子的亚细胞定位信息。本课题组前期通过对原始下载数据的提取，得到了用于建立模型的数据，包括蛋白质、大分子复合物、小分子和生化反应的编号和名称。

小分子代谢数据：来源于文献“The Edinburgh human metabolic network reconstruction and its functional analysis”[16]，该文献提供的数据收集了KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）[17]和HumanCyc（http://www.humancyc.org/）[18]数据库中的小分子代谢反应的相关数据。

1.2 基于实体语法系统的“忍冬藤化学成分-化学成分靶点-RA疾病靶点”生物网络构建

实体语法系统（Entity Grammar System，EGS）是针对复杂系统建模提出的一种形式化语法系统，可用来描述复杂系统的组成单位、组织方式和变化规律[19]。EGS用五元组G=（VN,VT,F,P,S）表示，其中各项分别表示非末端字符集，末端字符集，操作子集，规则集，初始字符。当不考虑或者不区分末端字符与非末端字符时，用四元组G=（V,F,P,S）表示，其中V=VN∪VT。操作子集F 的每一个元素表示字符的组织方式，字符采用这种组织方式所形成的单元E（V, F）叫实体。四元组分别对应于复杂系统建模的四个方面，即基本组成单位、复杂系统中的基本结构、由结构所组成的实体转换规则以及由基本组成单位按照结构类型组成的特定实体。实体语法系统可以由特定的实体出发，根据特定的转换规则进行推演得到新的实体。

本研究将实体语法系统用于忍冬藤化学成分靶点，作用于RA 相关靶点的生物网络构建和中药作用效应在背景网络中的传递和推演，V 主要包含组成忍冬藤作用生物网络的节点类型，包括中药化学成分及其作用靶点，疾病名称以及相关蛋白靶点，复杂小分子和蛋白等；F 包括网络中节点关系类型以及为后续推断过程所准备的虚拟实体类型；P 所包含的规则用于忍冬藤作用靶点与RA疾病靶点关系的推断；F包括网络中的各种节点关系类型（interaction，neg，pos 等），通过以上原理来进行忍冬藤作用机理的解析。推理规则如下：

1.3 网络可视化

Cytoscape 是一个基于Java 技术的开放源代码的网络可视化软件平台，主要用于复杂生物网络的构建和分析[20]。本研究利用Cytoscape 3.7.1 绘制生物网络图，展示forward(C,D,F,M)中的生物分子。在生物网络中，“节点（node）”表示化学成分、靶蛋白、以及其他小分子，“边（edge）”表示化学成分与靶点之间的关系。

表1 忍冬藤治疗RA的有效成分

1.4 拓扑结构分析

网络拓扑结构用于表示整个网络的结构外观，反映各结点之间的结构关系。本研究利用Cytoscape

3.7.1 软件中CytoNCA 插件进行拓扑结构分析，以degree 值、betweenness 值、closeness 值大于其平均值的节点为指标进行筛选，得出网络关键节点，即忍冬藤治疗RA的关键作用靶点。

1.5 网络富集分析

David是一种整合多种数据库资源的数据库，运用改良的Fisher精确检验算法实现对基因集的富集分析。本研究利用DAVID 6.7 Functional Annotation Clustering中Gene Ontology 的分子功能条目对关键蛋白的生物过程（BP）进行KEGG 通路富集分析[21]。选择P＜0.05和FDR ＜0.05的条目作为显著富集的通路，即忍冬藤治疗RA的生物通路。

2 结果与分析

2.1 忍冬藤化学成分作用于RA相关靶点的生物网络

本研究建立了忍冬藤、RA 相互作用的生物网络，以忍冬藤中所有化学成分为起点，RA 为终点，将忍冬藤的化学成分与RA 的相关蛋白连接，深入探讨忍冬藤抗类风湿关节炎的作用机制，忍冬藤化学成分作用于RA 相关靶点的生物网络（见图1），共包括2 289 个节点和5 278 条边。生物网络中，红色菱形代表忍冬藤治疗RA 的有效化学成分，包括：木樨草素、绿原酸、芦丁、芳樟醇、棕榈酸、丁香酸、槲皮素等31 个化学成分；绿色圆形代表化学成分的靶点蛋白；蓝色正方形代表网络中的小分子复合物；橙色三角形代表网络中的小分子；黄色平行四边形代表生物化学途径。灰色的边代表忍冬藤中某化学成分对其相关靶点为促进作用，黑色的边代表抑制作用，粉色的边代表未知的相互作用关系。

2.2 忍冬藤治疗RA的有效成分

将生物网络中能通过一条或多条生物途径作用到RA相关靶点的化学成分作为忍冬藤治疗RA的有效成分，最终得到包括木樨草素、绿原酸、芦丁、芳樟醇、棕榈酸、丁香酸、槲皮素等在内的31个有效成分（见表1）。

木樨草素[22]和咖啡酸[23]均具有抗炎、免疫调节作用，可调节免疫应答、影响炎症反应及调控细胞生长，在控制类风湿关节炎病程进展中发挥抗炎、抗免疫作用，减轻类风湿关节炎恶化；Li等[24]曾建立胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型，得出芹菜素可通过抑制滑膜增生、血管生成和破骨细胞生成来抑制CIA，从而实现对RA 的保护作用；芦丁可通过抑制NF-κB 信号通路降低氧化应激和促炎细胞因子，从而抗RA[25]。槲皮素可减少RA 软骨细胞基质降解和细胞凋亡，可抗骨内细胞衰老，从而预防和治疗骨关节破坏，在多种关节疾病中均有保护和治疗作用[]。丹皮酚具有明显的抑制滑膜组织炎症反应和RA 进展的作用，潜在机制可能是 通 过 衰 减TLR4-NF-κB 激 活 实 现[29]。Somaiya Mateen等[30]发现外周血单个核细胞（PBMC）培养中，发现丁香酚对RA患者的PBMC培养具有明显的抗炎、抗氧化作用。由此可见，本研究得到的忍冬藤抗RA 的有效成分具有一定可靠性。

2.3 忍冬藤治疗RA的关键疾病靶点

利用CytoNCA 插件对网络进行拓扑结构分析，取Degree 值、Betweenness 值、Closeness 值大于其平均值的节点，包括CYP17A1、CYP8B1、POMC、CYP19A1、

AKT1、 CYP1B1、 MAPK1、 AKR1B1、 JUN、 SP1、BHLHE39、CYP1A1、PPARA 共计13 个，为忍冬藤治疗RA的关键靶点（见表2）。

图1 忍冬藤化学成分作用于RA相关靶点的生物网络

经文献调研发现，本研究得到的13个忍冬藤治疗RA 的关键靶点蛋白均与RA 有关。例如，脑内p-内啡肽在中枢中分布广泛，具有较强的吗啡样活性，对RA有较强的镇痛作用。POMC（阿黑皮素原）为脑内p-内啡肽的前体物质，因此POMC 表达水平越高则镇痛效果愈加显著[31]。另外，RA 是一种自身免疫疾病[32]，促肾上腺皮质激素是一种可调节免疫系统中大多数细胞，对神经、免疫、内分泌系统均有调节作用的激素，POMC 是促肾上腺皮质激素的前体物质，因此POMC表达水平越高则免疫调节能力越好。破骨细胞是导致RA骨破坏的主要原因之一[33]，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信号通路活化是破骨细胞形成的关键通路[34]，抑制p38 MAPK信号通路可减少破骨细胞分化，减轻动物实验性关节炎进程和关节损伤[35]。综上所述，本研究得到的忍冬藤抗RA的关键靶点具有一定可靠性。

2.4 忍冬藤治疗RA的关键通路分析

本研究对表2 中13 个关键靶点进行富集分析，共得到55条通路（见表3）。

表2 忍冬藤治疗RA的关键靶点蛋白

富集分析所得生物通路大致可分为：激素调节、脂质代谢调控、细胞周期及凋亡调控、促肝脏发育四方面。从动物、人类流行病学统计的数据发现，RA 发病高峰期与绝经期相吻合，这提示雌激素缺乏可能是RA 的发病原因之一[36]。实验研究表明，接受卵巢切除（OVX）降低雌激素水平的小鼠，与接受雌激素治疗的OVX 小鼠或者未接受OVX 的正常雌激素水平小鼠相比，关节炎发生率高且病情更严重[37]。早在十五年之前，便有研究发现激素替代疗法可减少红细胞沉降率、血清血红蛋白水平升高、增加骨密度，使关节糜烂进展减慢，临床疗效改善，同样证明激素水平在RA 病程中必须给予关注[38]；另有临床研究表明，雌激素可在一定程度上抑制破骨细胞活性，促进成骨细胞增殖[39]。综合上文可知，本研究通过富集分析所得激素的调节、代谢相关通路GO：0034754、GO：0042445、GO：0010817、GO：0009725可能是忍冬藤治疗RA的生物通路。

Andonian Brian J等[40]发现，肥胖或超重的RA患者比体重正常的RA 患者滑膜炎更严重；Ferguson Lyn D等[41]以腰围为指标评判中心性肥胖与RA的联系，发现中心性肥胖会增加RA 患病率。脂质摄入过多会导致肥胖、脂肪酸代谢途径、类固醇的代谢过程均会调控肥胖，从而影响RA 发病率。由此可知，类固醇代谢过程（GO:0008202）、对脂多糖的反应（GO:0032496）、脂肪酸-氧化的调节（GO:0031998）、调节脂质分解代谢过程（GO:0050994）、脂肪酸氧化的调节（GO:0046320）、脂类生物合成的过程（GO:0008610）、脂质代谢过程的正向调控（GO:0045834）、脂肪酸代谢过程的调节（GO:0019217）均为忍冬藤治疗RA的关键生物途径。

RA 属风湿痹症，系肝肾亏虚、精血不足、筋骨失养所致。根据中医基础藏象学说，肝主疏泄、主藏血，包括肝、胆等脏器[42]。另外，肝脏化学成分异常、肝纤维化经常出现在RA 病程中。因此，肝脏发育（RAGO:0001889）是忍冬藤治疗RA的一条潜在的生物途径。

RA 为慢性疾病，发病时伴有关节损伤和骨质破坏，在RA 的病程中，破骨细胞分化和破骨细胞相关蛋白的上调会导致关节被侵袭和破坏[43]。可分化为破骨细胞的前体包含单核细胞、巨噬细胞、DCs（不成熟树突状细胞）及MDSCs（骨髓来源的抑制性细胞），而细胞分化涉及基因表达、转录、蛋白质翻译等过程，因此细胞生物合成过程的正向调控（GO：0031328）、蛋白质运 输（GO：0017038）、基 因 表 达 的 正 调 控（GO：0010628）可能是忍冬藤治疗RA的相关生物通路。

有研究[44]发现，miRNA 的异常表达与滑膜细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移关系密切，参与RA 炎症反应、免疫反应、敏感性和骨破坏，调控细胞信号通路和细胞外基质降解，是RA 的潜在诊断标志物和治疗靶点。因此，细胞凋亡的正向调控（GO：0043065）、细胞死亡的正调控（GO：0010942）也可能是忍冬藤治疗RA 的生物通路。

综上所述，已有相关报道的和RA 相关的生物通路共涉及四个方面，说明忍冬藤可通过48条生物通路治疗RA。目前，本研究还不能确定其他7条生物通路是否是忍冬藤治疗RA的生物通路。

3 结论与展望

忍冬藤是治疗风湿痹症、抗RA 的临床常用药，本研究基于“实体语法系统”构建忍冬藤抗类风湿关节炎生物网络，探讨忍冬藤抗RA 的有效成分和作用机制。不同于蛋白质互作网络[45]，本研究所构建的生物网络包含蛋白、基因、小分子代谢物等人体内所有小分子类型，使网络模型具有更高的仿真能力。

本研究通过对忍冬藤抗类风湿关节炎生物网络的分析，辨识出忍冬藤抗RA的31个有效成分，包括木樨草素、芹菜素、芦丁、槲皮素、丁香酸等。忍冬藤的31 个 有 效 成 分 作 用 于CYP17A1、CYP8B1、POMC、CYP19A1 和AKT1 等13 个关键靶点，通过以下五点发挥作用：①激素调节影响破骨细胞的活性；②脂质、脂肪酸代谢途径影响体脂率；③调控转录和翻译过程影响细胞分化成破骨细胞；④调控RNA的表达和细胞凋亡，影响免疫反应、炎症反应；⑤调节肝脏发育，从而发挥治疗类风湿性关节炎的作用。

通过文献调研发现，大部分有效成分具有抗RA作用，大部分生物通路为忍冬藤治疗RA 的生物通路，这说明基于网络药理学探讨忍冬藤抗RA 的有效成分及作用机制具有可靠性。但是，有些化学成分的抗RA作用以及少部分生物途径（如GO:0055114、GO:0010557）是否和RA相关还未见报道。

随着网络药理学相关技术和数据库的发展，本研究将构建包含机体内所有生物分子类型的动态生物网络，提高生物网络的仿真能力。本课题组将进一步验证本次研究得到的有效成分是否为忍冬藤抗RA 的有效成分，为抗RA 的新药研发奠定基础；将明确7 条生物通路是否是忍冬藤治疗RA 的生物通路，为RA 发病机制研究提供依据。