糖耐康对db/db小鼠肝脏p38MAPK/NF-κBp65信号通路的影响＊

王明慧，吴丽丽，秦灵灵，吴 悠，刘 玮，田 芃，宋紫临，张程斐，刘铜华**

（1. 陕西中医药大学第一临床医学院 咸阳 71200；2. 北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室 北京100029 ；3. 北京中医药大学科技处 北京 100029 ；4. 北京中医药大学东方医院 北京 100029）

2 型糖尿病是机体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗，以糖脂代谢紊乱为主要特征的内分泌疾病。非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是糖尿病最常见的并发症，其在发展过程可能从非酒精性单纯性脂肪肝演变成非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及相关肝硬化和肝癌，普通成人NAFLD患病率为6.3%-45%，严重地威胁人类的健康[1-2]。目前，NAFLD 已经成为引起肝脏疾病的首位原因，并呈大众化、低龄化趋势，早期治疗及诊断有着重要意义。中医药在NAFLD治疗方面积累了丰富的经验，特别是对NAFLD 取得了较好的临床疗效。糖耐康是导师刘铜华教授结合中医理论和现代药理学研究治疗2型糖尿病的临床经验方，课题前期研究[3]表明，糖耐康可调节小鼠糖脂代谢紊乱、降低炎症因子（TNF-α、IL-6、CRP）的表达水平而改善整体和局部代谢性炎症反应。本研究以db/db 小鼠为实验对象，基于p38MAPK/NFκBp65 信号通路，探讨糖耐康对db/db 小鼠脂肪肝的影响。

1 材料

1.1 动物

BKS.Cg-m+/+Leprdbrdb/J（db/db）小 鼠16 只 和Dock7m+/+Leprdb（db/m+）小鼠8 只，雄性，6-8 周龄，购自南京大学模式动物研究所，合格证号SCXK（苏）：2015-0001。小鼠饲养于北京中医药大学SPF 级动物房，室温（24±2）℃左右，空气湿度40%左右，每日12 h光照维持。动物自由饮水，以正常维持饲料喂养，饲料由北京中医药大学动物房提供。动物实验通过北京中医药大学动物伦理委员会批准（批准号：BUCM-4-2018080101-3030）。

1.2 药物与试剂

血糖试纸（爱科来国际贸易有限公司，批号：K183D36）；全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：NO.20190327）；ELISA 试剂盒TNF-α、IL-6、IL-1β（北京索莱宝科技有限公司，批号：NO.20190701）；p-p38 MAPK 抗体、p38 MAPK 抗体、NF-κBp65 抗体、β-actin抗体（CST 公司）、30%聚丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（北京普利莱基因技术有限公司）、胞核胞浆胞膜制备试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。糖耐康颗粒（3 g/袋，由夏枯草、女贞子、番石榴叶、三白草和人参组成，四川美大康药业股份有限公司生产）。

1.3 仪器

离心机（美国SIGMA 公司，型号：3K15）；酶标仪（美国Promega 公司，型号：E9032）；快速血糖仪（爱科来国际贸易上海有限公司，型号：GT-1941）；倒置显微镜（日本OLYMPUS 公司，型号：IX71 型）；垂直电泳仪（美国BIO-RAD 公司，型号：Mini-PROTEAN Tera System）；凝胶成像仪（美国BIO-RAD 公司，型号：ChemiDocTM XRE with Image LabTM Software）。

2 方法

2.1 分组与给药

6-8 周龄db/db 小鼠，适应性喂养1 周后，连续两日早上8:00 进行尾静脉血血糖监测，尾静脉随机血糖≥11.1 mmol/L，则选入实验组。按血糖及体重，随机将16 只db/db 小鼠分为2 组：糖耐康组（3.24 g/kg）、模型组（灌胃等体积超纯水）及另设同周龄的8 只db/m+小鼠作为正常组（灌胃等体积超纯水），每组8 只。根据给药量配比合适浓度后，按照5 mL/kg 体重灌胃，正常组和模型组按照相同给药系数进行超纯水灌胃，每日下午同时间段给药一次，连续给药干预8周。

2.2 取材

第8 周，末次给药后禁食不禁水12 h，摘取眼球取血，静置3 小时后3000 r/min，10 min 离心分离血清，-20℃保存；取小鼠肝脏组织，多聚甲醛固定，其余组织-80℃冻存。

2.3 检测指标及检测方法

2.3.1 血清指标

空腹血糖由血糖仪及配套试纸测定，全自动生化仪测定血脂四项（TC、TG、LDL-C、HDL-C）及FFA、肝功两项（ALT、AST），严格按照说明书步骤测定。

2.3.2 肝脏组织匀浆及相关指标测定

2.3.2.1 肝脏组织匀浆制备从-80℃冰箱取肝脏组织，剪切成细小的碎片，每20 mg组织加入200 μL裂解液、2 μL蛋白酶抑制剂和2 μL磷酸酶抑制剂，冰水浴制备均浆后的样品12000 g离心5分钟，取上清液待测。使用BCA法进行蛋白浓度测定，冻存在-20℃备用。

2.3.2.2 Elisa 法检测TNF-α、IL-6、IL-1β 炎症因子的含量取肝组织匀浆上清，将样品与标准品加入96孔板中并按说明书加入相应试剂，37℃孵育90 min。拍板、洗板4 次，加入酶标试剂，37℃孵育60 min。洗板、拍板5 次，加入显色液，37℃显色避光15 min。加入终止液，5 min内酶标仪读取OD值并处理数据。

2.3.3 病理学检测

包埋：肝脏组织置于4%组织固定液内固定，梯度乙醇溶液脱水，石蜡包埋。

染色和封片：二甲苯脱蜡、100%、90%、80%、70%梯度乙醇脱水，苏木素染细胞核、伊红染细胞质，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，中性树胶封片，显微镜观察肝组织形态学的变化。

2.3.4 蛋白免疫印迹检测

从-80℃冰箱取50 mg 左右小鼠肝脏组织，置于冰上剪碎，加入含有裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂及研磨钢珠的2 mL EP 管中，使用研磨机研磨后，冰上静置30 min，离心4℃，12000 rpm，15 min，吸取上清，获得总蛋白样品。上清液和上样缓冲液混匀煮沸制备成蛋白电泳样品。①电泳：上样每孔加20 μL，10 min 90v 浓缩胶，60 min 100v 分离胶。②转膜：预处理好的海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵依次顺序做成三明治样装好，100v 湿转60 min。③封闭：Blocking one/Blocking one-P 封闭60 min。④加一抗、二抗：一抗根据说明书按1：1000 比例稀释，4℃孵育过夜，TBS（Tris缓冲液）洗膜后二抗（1∶1000）37℃摇床孵育1 h。⑤洗膜后加ECL发光液，室温反应2 min，凝胶成像仪成像，使用Image J 软件对条带进行灰度值分析。

2.4 统计学分析

数据采用统计软件SPSS 20 进行分析统计，结果采用均数±标准差（±s）形式表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法。P＜0.05表示结果有统计学差异，P＜0.01 表示结果有统计学显著差异。

表1 对db/db小鼠体质量的影响/g（n=8，± s）

表1 对db/db小鼠体质量的影响/g（n=8，± s）

注：与正常组相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

第8周24.28±1.03 48.60±2.72＊＊46.53±2.60组别正常组模型组糖耐康组第1周21.24±0.80 38.52±1.18＊＊37.78±1.52第4周24.03±0.76 45.16±1.96＊＊44.04±1.83

表2 对db/db小鼠肝重的影响/g（n=8，± s）

表2 对db/db小鼠肝重的影响/g（n=8，± s）

注：与正常组相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

肝脏指数0.055±0.0006 0.065±0.0022＊＊0.05±0.0015＃＃组别正常组模型组糖耐康组肝重1.34±0.04 3.15±0.15＊＊2.19±0.18＃＃

3 结果

3.1 糖耐康对db/db小鼠一般情况的影响

正常组db/m+小鼠精神良好，活动自如，皮毛光泽。与正常组相比，db/db 小鼠出现精神萎靡、毛色欠佳、少动贪吃等现象。与模型组比较，糖耐康组体重下降，但无统计学意义；糖耐康组肝脏指数显著下降（P＜0.01）（见表1、表2）。

3.2 糖耐康对db/db小鼠糖脂代谢影响

与正常组比较，模型组空腹血糖、ALT、AST、TG、TC 和FFA 的表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，糖耐康组空腹血糖、ALT、AST、TG、TC 和FFA 的表达水平显著下降（P＜0.05 或P＜0.01）（见表3、表4、表5）。

3.3 糖耐康对db/db小鼠肝脏组织形态学变化

肝脏组织形态学结果显示，正常组小鼠肝细胞大小、形态均匀正常，细胞核居中，胞质丰富，以中央静脉为中心，肝小叶排列整齐；模型组小鼠肝小叶结构不清晰，肝细胞体积明显增大、排列混乱，胞质可见大小不等的脂肪空泡，将细胞核挤向一边，有炎症细胞浸润，可见弥漫性肝细胞脂肪变性。与模型组相比，糖耐康组肝脏病理表现以轻度至中度脂肪变为主，肝细胞形态大致正常，肝细胞内脂肪空泡减少，炎症细胞浸润减少（见图1）。

表3 空腹血糖水平/mmol·L-1（n=8，± s）

表3 空腹血糖水平/mmol·L-1（n=8，± s）

注：与正常组相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

第8周5.04±0.98 32.89±2.88＊＊26.13±2.38＃组别正常组模型组糖耐康组第1周4.09±0.13 22.26±2.07＊＊21.5±2.21第4周4.06±0.51 27.30±1.41＊＊22.43±1.67＃

表4 对db/db小鼠血清ALT、AST水平的影响/mmol·L-1（n=8，± s）

表4 对db/db小鼠血清ALT、AST水平的影响/mmol·L-1（n=8，± s）

注：与正常组相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

AST 121.78±10.69 189.13±14.51＊＊144.33±18.26＃＃组别正常组模型组糖耐康组ALT 36.81±4.80 86.80±8.00＊＊58.78±7.62＃＃

3.4 糖耐康对db/db小鼠肝脏组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平的影响

与正常组比较，模型组炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，糖耐康组小鼠肝脏组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平显著下降（P＜0.05或P＜0.01）（见表6）。

3.5 糖耐康对db/db 小鼠肝脏组织p-p38MAPK、NFκBp65蛋白表达水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠肝脏组织p-p38 MAPK、核NF-κBp65蛋白表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，糖耐康组小鼠肝脏组织p-p38MAPK、核NF-κBp65 蛋白表达量显著下降，总p38MAPK 的蛋白水平没有变化（P＜0.05或P＜0.01）（见表7、图2）。

4 讨论

非酒精性脂肪肝是以肝实质细胞脂肪变性和肝小叶内炎症为特征的一类疾病，其发病机制复杂，与炎性细胞因子分泌、脂质代谢和胰岛素抵抗密切相关[4-5]。其中，肝组织炎症反应是NAFLD 的重要致病机制之一[6-7]。P38 丝裂原活化蛋白激酶是MAPK 家族一员，是真核生物细胞内的一类丝裂酶原激活的蛋白酶原，可受多种细胞外刺激而磷酸化激活，并参与炎症反应。p38MAPK 蛋白磷酸化，调控下游因子，促使效应细胞生成并释放TNF-α、IL-6 等多种炎性因子，造成肝细胞损伤[8-9]。TNF-α、IL-6 增强肝脏局部炎性反应，最终导致NAFLD 的发生。NF-κB 是一个转录因子蛋白家族，其中p65 蛋白作为NF-кB 通路蛋白家族的重要组成，其参与慢性炎症的调节过程。NF-κB能促进肝细胞脂肪变性以及TNF-α、IL-6 等炎症细胞因子表达的增加，从而引起脂肪性肝损伤。因此抗炎将有利于NAFLD的治疗[10]。

表5 血脂及FFA水平/mmol·L-1（n=8，± s）

表5 血脂及FFA水平/mmol·L-1（n=8，± s）

注：与正常组相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

FFA 0.92±0.12 2.92±0.22＊＊2.2±0.28＃组别正常组模型组糖耐康组TC 2.24±0.14 3.91±0.15＊＊3.27±0.25＃＃TG 0.7±0.07 2.22±0.26＊＊1.28±0.17＃＃LDL 0.44±0.08 0.52±0.10 0.48±0.06 HDL 2.14±0.14 2.33±0.29 2.28±0.14

图1 小鼠肝组织石蜡切片HE染色光镜观察结果（X200）

表6 肝脏组织中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子表达水平/pg·mL-1（n=6，± s）

表6 肝脏组织中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子表达水平/pg·mL-1（n=6，± s）

注：与正常组相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

IL-1β 150.85±27.75 782.55±61.67＊＊469.67±25.25＃＃组别正常组模型组糖耐康组TNF-α 104.12±17.40 565.79±25.00＊＊323.37±22.11＃＃IL-6 62.44±10.58 254.69±32.6＊＊176.24±18.2＃＃

表7 p-p38MAPK、NF-κBp65蛋白表达结果（n=6，± s）

表7 p-p38MAPK、NF-κBp65蛋白表达结果（n=6，± s）

注：与正常组相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

NF-κBp65/β-actin 0.19±0.03 1.16±0.12＊＊0.7±0.03＃＃组别正常组模型组糖耐康组p-p38MAPK/p38MAPK 0.55±0.03 1.05±0.05＊＊0.65±0.02＃＃

图2 小鼠肝组织p-p38MAPK、NF-κBp65蛋白表达情况

非酒精性脂肪肝据临床症状可归属于中医“胁痛”“积聚”“痰浊”“肥气”等范畴，其发病机制为本虚标实，肝脾亏虚，痰湿内阻。中医药治疗非酒精性脂肪肝具有很大的优势，糖耐康是导师刘铜华教授临床经验方，糖耐康以夏枯草为君药，归肝、胆经，具有清热泻火，散结消肿的功效；臣药番石榴叶有清热解毒、燥湿健脾的功效，三白草有清热解毒、利尿消肿的功效；佐药是人参、女贞子滋补肝肾的功效。故糖耐康燥湿祛痰，滋补肝脾，标本兼顾，在非酒精性脂肪肝的临床治疗中疗效显著。根据现代药理学实验研究，组方中单味药夏枯草中迷迭香酸能降低炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、CCL20 和TNF-α 的表达，下调NF-κB信号通路，具有一定抗炎作用[11]。番石榴叶具有抗炎、抗氧化、降血糖和血脂等多种药理活性[12]。三白草所含的金丝桃苷、三白脂素-8和人参中人参皂苷具有明显的抗炎作用[13-14]。女贞子中有效成分齐墩果酸具有保肝活性和抗炎作用[15]。既往研究表明，糖耐康在体内和体外实验有改善紊乱的糖脂代谢作用，且临床疗效确切[16-19]。

本实验研究以db/db小鼠为NAFLD 模型，db/db小鼠是因基因突变导致瘦素受体缺失，不能产生饱腹感，食量增大而导致脂肪堆积，继而出现肥胖和高脂血症等表现。饲养期间，db/db 小鼠肝脏脂肪含量的逐渐增加导致NAFLD，随后可伴有轻度肝脏炎症。db/db 小鼠肝脏质量明显高于正常组，而糖耐康干预后相较于模型组，肝脏质量下降。从整体水平观察糖耐康对db/db 小鼠糖脂代谢的影响，结果表明，与模型组相比，糖耐康可降低空腹血糖、TG、TC、FFA的含量，降低AST、ALT水平。进一步研究发现，糖耐康可下调肝脏组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表达水平，可显著下调p-p38 MAPK、核NF-κBp65 的蛋白表达水平，表明糖耐康降低db/db 小鼠肝脏组织炎症反应相关因子的表达，可能与抑制p38 MAPK/NF-κBp65信号通路有关。

综上所述，糖耐康可能通过调节p38 MAPK/NFκBp65信号通路，改善db/db小鼠的糖脂代谢紊乱和肝功能，减少脂肪在肝脏中的蓄积，下调肝脏组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表达水平，并对肝脏有一定保护作用。