蜂胶降脂方对高脂血症模型斑马鱼的降血脂作用研究＊

李心怡，陈荷清，夏 欢，林 生，商洪才，田贵华＊＊

（1. 北京中医药大学东直门医院 北京 100700；2. 北京奥金达农业科技发展有限公司 北京 101507）

高脂血症（Hyperlipidemia）是常见的脂质代谢性疾病，主要表现为甘油三酯（Triglyceride，TG）、胆固醇（Cholesterol，TC）、低 密 度 脂 蛋 白（Low density lipoprotein，LDL-C）及高密度脂 蛋 白（High density lipoprotein，HDL-C）的代谢异常[1-3]。2012 年流行病学调查显示，中国成人血脂异常的患病率约为40.40%[4]；另有调查表明，全国高胆固醇血症的患病率为4.9%，高甘油三酯血症的患病率为13.1%[5]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素之一，其防治已成为预防和控制心脑血管事件发生的重要措施。

临床上推荐在控制饮食及保持运动的基础上，使用他汀类药物控制血脂。他汀类药物虽能取得较好的降脂作用，但仍存在使转氨酶升高、血糖升高、胃肠道症状等不良反应[6-7]。因此，如何在降脂同时减轻不良反应是高脂血症研究关注的重点之一。中医理论中的“膏脂”与临床中血脂的涵义相近，其形成多与脾虚、痰湿相关，正如《王氏医存》所言：“肥人多痰，肥人之病，皆因脾湿所致”。故中医药在治疗高脂血症时多从健脾化痰入手，具有疗效好、副作用小等优点[8]。蜂胶降脂方主要由药食同源的蜂胶、红曲、山楂组成，其中蜂胶、红曲、山楂均有降脂化浊的功效，且更为安全、不良反应小。本研究拟对蜂胶降脂方的降脂功效进行研究，并探索该组方对TG和TC的具体调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

黑色素等位基因突变型半透明Albino 品系斑马鱼由杭州环特生物科技股份有限公司提供。斑马鱼以自然成对交配繁殖方式进行养殖，饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1L 反渗透水中加入200 mg 速溶海盐，电导作用为480-510 μS/cm；pH 为6.9-7.2；硬度为53.7-71.6 mg/L CaCO3），实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

1.1.2 实验药物的制备

本研究选用的蜂胶降脂方来源于本课题组研究团队临床实践的经验总结，主要由蜂胶、红曲、炒山楂、荷叶和炒杜仲共5种药物组成，实验所用各生药均为10 g，其中研究所用蜂胶由北京奥金达农业科技发展有限公司提供，其余生药由东直门医院中药房提供。实验前，研究人员将蜂胶原品打粉备用。用纯水浸泡除蜂胶外的其余生药，30 min后倒出纯水，加入蜂胶粉末，再加纯水500 mL 至煮沸并持续煎煮20 min，然后将所得药液倒入量杯中。再次添加纯水500 mL沸水煎煮15 min，倒出第二煎药液，合并两煎药液并浓缩至300 mL作为母液，母液为棕色液体，置于4℃冰箱备用。

阿托伐他汀钙（白色粉末，批号为LRAA9254，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用二甲亚砜（DMSO）配制成浓度为24 mg/mL 的母液，稀释1000倍，置于4℃冰箱备用。实验时阿托伐他汀钙溶液浓度为0.24 μg/mL。

1.1.3 仪器与试剂

实验所需仪器与相关试剂包括：解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，日 本）；心 跳 血 流 分 析 系 统（ViewPoint Life Sciences，法国）；与显微镜相连的相机（VertA1）；精密电子天平（CP214，OHAUS，美国）；多功能酶标仪（Mithras LB940，Berthold Technologies）；6 孔板（Nest Biotech，中国）；96 孔酶标板（costar，美国）；甲基纤维素（Sigma，美国）；鸟类用蛋黄粉（批号20170626，北京开元牌）；油红O（Oil Red O，批号SLBP5248V，Sigma）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma，法国）；甘油三酯（TG）测试盒（批号20190327，南京建成）；总胆固醇（Total Cholesterol，T-CHO）测试盒（批号20190325，南京建成）。

1.2 分组与方法

1.2.1 实验分组

挑选受精后发育正常的斑马鱼，首先进行药物最大耐受浓度测定（Maximum talerated concentration，MTC）。将中药母液按比例进行稀释并分为5组，各组浓度分别为1.5625 μL/mL、3.125 μL/mL、6.25 μL/mL、12.5 μL/mL 及25 μL/mL。将180 尾斑马鱼随机分为6组，每组30 尾，其中5 组分别给予不同浓度的中药汤药溶液，另有1 组为正常对照组，给予养鱼用水饲养。根据MTC 结果进行蜂胶降脂方降血脂实验，实验中将斑马鱼随机分为正常对照组、高脂血症模型组、中药实验组及阿托伐他汀钙对照组。

1.2.2 实验方法

1.2.2.1 MTC测定

随机选取180 尾受精后7 天（7 days post-fertiliza⁃tion，7dpf）的斑马鱼置于六孔板中，每孔（实验组）处理斑马鱼30 尾，分别给予1.5625 μL/mL、3.125 μL/mL、6.25 μL/mL、12.5 μL/mL、25 μL/mL 的中药汤药和养鱼用水，每孔（实验组）容量为3 mL。48 h 后观察并记录斑马鱼的表型和死亡情况。

1.2.2.2 蜂胶降脂方的降血脂作用研究

随机选取5dpf 的斑马鱼置于烧杯中，用蛋黄粉溶解成0.1%水溶液喂饲斑马鱼，每天喂食8 小时，建立高血脂模型。模型建立后，随机选取90尾模型斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）容量3 mL，处理斑马鱼30尾；分别予中药汤药、阿托伐他汀钙溶液及养鱼用水，其中中药汤药浓度根据MTC 结果确定，阿托伐他汀钙溶液浓度为0.24 μg/mL。同时，设置正常对照组斑马鱼30尾，给予养鱼用水。48 h后将斑马鱼取出用0.3%的油红O 液进行染色。3 h 后进行脱色再置于解剖显微镜下观察斑马鱼尾部血管油红O 附着情况，计算血脂光密度总和（Total light density of blood lipid，S）。

1.2.2.3 蜂胶降脂方的血脂代谢机制研究

随机选取5dpf 的斑马鱼置于烧杯中，用蛋黄粉喂饲斑马鱼建立高血脂模型。模型建立后，随机选取120尾模型斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）容量3 mL，处理斑马鱼30尾。中药汤药组3组，分别予0.69 μL/mL（1/9 MTC）、2.08 μL/mL（1/3 MTC）和6.25 μL/mL（MTC）浓度的中药汤药稀释溶液，阿托伐他汀钙组予0.24 μg/mL浓度的稀释溶液。另设置正常对照组和模型组各30尾，予养鱼用水。48 h 后随机取出部分斑马鱼加入匀浆介质，进行匀浆并离心，后取上清液再用TG 及TC 试剂盒测定TG 及TG 含量。另随机选取斑马鱼置于心跳血流分析系统下观察其血流速度的变化。

2 观察指标

2.1 血脂光密度总和（S）

研究员用油红O 对斑马鱼进行染色。取出斑马鱼固定后，用PBS 洗脱。室温下，用丙二醇进行脱水。脱水后，将斑马鱼放于0.5%的油红O 染色液中，染色过夜。过夜后，用丙二醇进行脱色。脱色完成后，洗脱，置于甘油中保存。观察时，将斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，观察斑马鱼尾部血管油红O 附着情况，利用Image-Pro Plus 6.0 高级图像处理软件进行图像分析并采集数据，分析统计斑马鱼尾部血管血脂光密度总和（S），根据光密度总和的统计学结果评价中药汤剂的降血脂作用。降血脂作用计算公式如下：

2.2 甘油三酯（TG）和胆固醇（TC）

研究员在各组处理48 h 后，随机取出部分斑马鱼加入匀浆介质，进行匀浆并离心，以1500 g 离心5 min后取上清液。离心管于室温静置15 min 后再用TG 及TC 试剂盒测定斑马鱼体内TG 和TC 的含量，根据TG和TC 的含量结果评价蜂胶降脂方对高血脂模型斑马鱼TG和TC的影响。

2.3 血流速度

各组处理48 h后，每组随机挑选10尾斑马鱼置于心跳血流分析系统下录制斑马鱼血流视频，分析斑马鱼血流速度，以血流速度的统计学分析结果评价蜂胶降脂方对斑马鱼血流速度的改善作用。心跳血流分析系统采用120 帧/秒高速摄像头和IEEE 800 Mbits 高速摄像头适配器，可轻松自定义静脉/毛细管位置的用户界面，实现视野范围内的多个粒子的跟踪，可进行实时视频捕获，进行高速视频分析。

3 统计方法

统计学处理连续型变量结果用mean ± SE 表示，数据处理用SPSS20.0 进行统计分析。其中，血脂降低作用（%）用T 检验进行统计分析，P＜0.05表明具有显著性差异。蜂胶降脂方对TG和TC的影响及对血流速度的作用，运用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，P＜0.05表明具有显著性差异。

表1 蜂胶降脂方处理后“浓度-致死性”结果（n=30）

4 结果

4.1 最大耐受度（MTC）结果

蜂胶降脂方在浓度为1.5625-6.25 μL/mL时，毒性表型上未见明显异常，死亡率为0%；在浓度为12.5 μL/mL 时，6.7%斑马鱼死亡（2/30）；而浓度为25 μL/mL 时，全部斑马鱼死亡（30/30）。故蜂胶降脂方对斑马鱼的最大耐受度（MTC）为6.25 μL/mL。具体结果见表1。

4.2 油红O染色及血脂光密度总和（S）结果

油红O 染色结果显示，正常组斑马鱼尾部血管无明显油红O 附着，高脂血症模型组斑马鱼尾部血管可见大量油红O 染料沉积，而阿托伐他汀钙组和蜂胶降脂方组斑马鱼尾部血管的油红O 染料附着较模型组明显减少。具体结果见图1、图2。计算各组的血脂光密度总和，模型组斑马鱼尾部血管光密度总和为10683 像素。阿托伐他汀钙组及蜂胶降脂方组与模型组相比，血脂降低作用分别为31% 和33%（P＜0.001）。这表明蜂胶降脂方与阿托伐他汀钙均有明显的降血脂作用。具体结果见表2。

4.3 TG及TC含量变化

如表3所示，模型组TG 含量较正常对照组明显增多（P＜0.01）。阿托伐他汀钙组TG 的整体含量（0.059 mmol/gprot）与模型组（0.135 mmol/gprot）相比明显 较低（P＜0.01）。而蜂胶 降脂 方0.69 μL/mL、2.08 μL/mL 及6.25 μL/mL 浓度组斑马鱼整体TG 含量分 别 为 0.064 mmol/gprot、0.052 mmol/gprot 和0.066 mmol/gprot，均低于模型组（P＜0.01）。故蜂胶降脂方和阿托伐他汀钙均能降低斑马鱼TG 水平。正常对照组（0.080 mmol/gprot）与阿托伐他汀钙组（0.157 mmol/gprot）TC 含量均低于模型组（0.258 mmol/gprot），P＜0.05，差异有统计学意义。蜂胶降脂方各浓度组斑马鱼整体TC 含量与模型组比较，P值均大于0.05，提示蜂胶降脂方各浓度组的TC 含量变化与模型组无统计学差异。故在本实验浓度条件下，蜂胶降脂方降低斑马鱼整体胆固醇水平作用不明显。

图1 造模后斑马鱼尾部油红O染色情况

图2 各组处理后斑马鱼尾部血管血脂染色情况图

4.4 血流速度变化

如表4 所示，模型组斑马鱼整体血流速度较正常组明显减缓（P＜0.001）；阿托伐他汀钙组的血流速度（374 μm/s）与模型组（289 μm/s）比较，其血流速度增加64%（P＜0.01），故阿托伐他汀钙能有效改善高脂血症斑马鱼整体血流速度。而蜂胶降脂方各浓度组处理后的血流速度及血流改善作用与模型组对比，其P值均大于0.05，提示蜂胶降脂方组斑马鱼的血流速度与模型组相比无统计学差异。

5 讨论

高脂血症是常见的脂代谢异常疾病，其引起的血液流变学异常和血流动力学异常是导致心脑血管事件发生的重要环节。高脂血症患者TG、TC 和LDL-C水平的升高，以及HDL-C水平的降低易使红细胞膜黏度增加，膜流动性降低，其变形能力减弱，携氧和运输氧气的能力减弱造成组织缺氧、微循环障碍。同时，TC水平的升高推动了脂质在动脉内壁沉积，加速动脉粥样硬化形成[9]。大量研究表明，高甘油三酯血症易增加冠心病、脑卒中和眼底病变等血管相关性疾病风险[10-12]，对糖尿病肾病的疾病进程也有推动作用[13-14]。2016 年《中国成人血脂异常防治指南》指出，TG 的轻中度增高与动脉粥样硬化性心血管疾病的发病风险相关[5]；且一项研究表明，男/女患者血液中TG 每升高1 mmol/L，其心血管疾病的发生率分别增加32%和76%[15]。一项meta分析结果显示，TG每升高1 mmol/L，动脉粥样硬化性心血管疾病的患病风险增加22%[15]。此外，TG严重增高还可提高急性胰腺炎的发病风险[5]。而高胆固醇血症也是引起心血管疾病增加的主要原因之一，可明显提高冠心病、脑卒中的发病率[16]；降低TC水平可显著减少冠心病的发病率及死亡风险[17]。

故治疗高脂血症是预防冠心病和脑卒中等致死、致残性疾病的重要措施。临床干预时，首推他汀类药物，其能有效降低TG、TC 及LDL-C 水平，中等剂量他汀类药物在降脂基础上能显著降低冠心病事件发生率，且不增加非心血管病风险[6]。但他汀类药物在取得良好疗效的同时，仍有少量不良反应，如肝功能异常、肌痛、血糖异常等，将影响患者的整体疗效及远期获益。

中医药在治疗高脂血症时，多认为高血脂水平属于“痰湿”范畴，与患者平素多食肥甘厚腻、饮食不节导致痰浊内生，或素体脾虚、年老体虚导致脾虚不能运化，湿浊停聚，化为脂浊相关[18-19]。此外，脂质水平升高，即膏脂运化失司，可使气血运行不畅，滞而为瘀；加之久病或年老气虚推动无力，血行不畅而瘀血内生，故高脂血症在中医主要与“痰湿”“瘀血”等病理产物相关。治疗时以健脾和胃、化湿降浊及活血化瘀为主。

表2 各组处理后高脂血症模型斑马鱼的降血脂分析结果（n = 10）

表3 各组处理后斑马鱼TG和TC分析结果（n = 3）

表4 处理后斑马血流速度结果（n = 10）

本课题组通过对比阿托伐他汀钙，研究了蜂胶降脂方对高脂血症模型斑马鱼的降血脂作用。结果表明，蜂胶降脂方能减少其尾部血管的血脂附着，降低体内TG 水平；但对TC 水平的调控及血流速度的改变无统计学差异。故蜂胶降脂方能通过降低TG 水平改善高脂血症模型斑马鱼的血脂异常情况。

蜂胶降脂方以蜂胶、红曲、山楂等药食同源的药物为主，配伍荷叶、炒杜仲共同起到降脂化浊的功效。其中，蜂胶收录于2005 版《中华人民共和国药典》，具有补虚弱、化浊脂、止消渴的功能[20]。蜂胶含有的黄酮类物质能有效降血脂、扩张冠状动脉、清除自由基等[21-22]，并且黄酮类物质的含量越高，蜂胶的辅助降脂作用越显著[23]。而红曲味甘，性温，是籼米发酵的产物，具有健脾消食、活血化瘀之效。有研究发现，红曲中含有的洛伐他汀是胆固醇合成酶HMG-CoA 还原酶的抑制剂。红曲中的洛伐他汀可抑制HMG-C0A 还原酶进而减少TC 合成[24-26]。动物实验结果也发现，红曲能降低高脂血症模型大鼠TC、TG 和LDL-C 的水平[28]；而临床研究结果提示，红曲能改善老年冠心病患者的血脂水平[28]。山楂可消食健胃、行气散瘀、化浊降脂，适用于嗜食肥甘厚腻导致的痰湿蕴脾。同时，现代研究表明山楂也含有黄酮类物质。另外，山楂内含有的三萜类物质可通过提高CYP7A1、LXRα、FXR 等脂代谢相关基因的表达水平量，促进胆汁酸合成及胆固醇排出体外[29-32]。荷叶入肝、脾、胃经，有清暑化湿之效。药理学研究显示，荷叶提取物能降低小鼠血清中TC、TG 及LDL-C 的水平，且荷叶提取物能调控小鼠HMGCR、SREBP-2、LXRα 及CYP7a1 的基因表达，影响其肝脏组织中TC 的合成与分解代谢[33]。此外，研究表明，杜仲中含有黄酮、绿原酸及环烯醚萜类化合物也具有较好的降血脂作用[33-34]。

综上所述，蜂胶降脂方中诸药能协同起到化浊降脂之效，降低高脂血症中TG 水平以改善高脂血症。但本研究仍存在一定不足，需进一步研究、探索。一方面，本研究结果显示对TC 水平的调控作用无显著差异，而相关研究已证实红曲、荷叶等单味药对TC 水平具有调节作用，故本研究拟进一步进行动物实验，探索组方中各味药物是否存在相互作用；另一方面，由于实验限制，在斑马鱼实验中未能探讨蜂胶降脂方对LDL-C 及HDL-C 的调节作用，而LDL-C 及HDL-C是血脂代谢的重要指标，故本课题组将在后续动物实验中对其进行探索、研究。

本研究所用蜂胶均由北京奥金达农业科技发展有限公司提供，感谢其对本研究的支持与帮助。