灌浆期高温与干旱对小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达的影响

卢红芳,石向军,胡阳阳,王晨阳,王家瑞,刘卫星,马 耕,康 娟

(1.河南农业大学农学院,国家小麦工程技术研究中心,河南郑州 450046; 2.河南省林州市农业科学研究所,河南林州 456550)

淀粉是小麦籽粒的主要贮藏物质，对小麦产量形成有重要作用。淀粉的合成与积累由一系列淀粉合成相关酶协同参与调节。小麦籽粒中，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成的关键酶和限速酶，包括5种同工酶：AGPS1-a,AGPS1-a,AGPS2, AGPL1和AGPL2；结合态淀粉合成酶(GBSS)有2种同工酶：GBSSI和GBSSII；可溶性淀粉合成酶(SSS)包括7种同工酶：SSI、SSIIa、SSIIb、SSIIc、SSIIIa、SSIIIb和 SSIV；淀粉分支酶(SBE)有4种同工酶：BEI、BEIIa、BEII和BEIII；淀粉去分支酶(DBE)有3种同工酶：ISA1、ISA2和PUL；淀粉磷酸化酶(PHO)主要与淀粉的降解有关，有2个同工酶：PHOL和PHOH；小麦籽粒淀粉合成主要受以上23个同工酶相应基因的协同表达作用调控[1]。

小麦籽粒淀粉合成与积累由一系列的生理、生化过程控制，受小麦遗传特性及生长环境的双重影响。水分和温度作为影响小麦生长发育的重要因素，对小麦籽粒淀粉合成有重要影响。高温胁迫可以抑制小麦中AGPase、SSS、GBSS和SBE的表达[2-4]，但其对大部分淀粉合成相关酶基因表达特性的影响还不清楚，例如对SSIIb、SSIIc、SSIIIb、SSIV、BEIIb、BEIII、GBSSII、ISAI、ISA2、PUL、PHOH、PHOL等[5]。有研究指出，在干旱条件下，水稻中GBSSI的表达量降幅不大，但直链淀粉的含量和直/支比显著降低[6]。有关干旱胁迫下小麦籽粒中淀粉合成酶基因表达的研究鲜有报道。

有关开花后短暂高温、干旱单因素胁迫对小麦籽粒灌浆和品质的影响已有较多研究[2,7-8]。小麦实际生产中，高温和干旱往往同时发生。花后不同时期遇到极端高温(35 ℃以上)和干旱双重胁迫时，会导致小麦籽粒灌浆期缩短，籽粒直、支链淀粉和总淀粉含量降低，籽粒蛋白质积累量和粒重下降，最终导致产量降低[9-11]。但有关高温与干旱对小麦籽粒淀粉合成与积累影响的机理研究还很少。本研究拟采用盆栽方式于灌浆期在人工气候室模拟高温与干旱胁迫，研究小麦籽粒淀粉合成关键酶相应基因的表达及淀粉含量的变化，以探讨高温与干旱胁迫对小麦籽粒淀粉形成的影响机理，为小麦抗逆栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

供试材料为高产强筋小麦品种郑麦366。

试验于2016—2017年度在河南农业大学科教试验园区，采用大田盆栽与人工气候室结合方式进行。

盆栽试验用土为耕层土壤(pH 8.0)，含有机质、全氮、碱解氮、速效磷和速效钾分别为18.3 g·kg-1、1.4 g·kg-1、57 mg·kg-1、68 mg·kg-1和204 mg·kg-1，田间持水量为 26.4%。试验用盆高27 cm、盆口直径24 cm，每盆装土10 kg。播种前每盆施纯氮1.15 g、P2O51.35 g 和K2O 1.15 g。三叶期定苗，每盆12株。拔节期结合浇水，每盆追施纯氮1.15 g。

开花期选择同一天开花、大小均匀的麦穗挂牌标记。于开花后第10天，将长势均匀一致的供试盆栽转移至人工气候室进行不同处理直至小麦成熟。人工气候室光照时间为每天8:00-18:00，光照强度为500 μmol·m-2·s-1，自动控温控湿，相对湿度控制在40%～60%范围内。设置适温(25 ℃/15 ℃)和高温(32 ℃/22 ℃)两种温度模式，每种温度模式下同时设正常水分处理(土壤相对含水量75%)和干旱处理(土壤相对含水量50%)，组成4个处理，即对照(CK)、干旱(DS)、高温(HT)和高温干旱复合胁迫(HT+DS)，每个处理15 盆。干旱处理自高温处理前 7 d开始控制浇水，采用称重法与土壤水分测定仪TDR300相结合的方法测定土壤含水量，确保高温处理时达到目标含水量。

高温处理前取样一次，之后每4 d 取一次样，直至小麦成熟。一部分籽粒样品于105 ℃杀青20 min，70 ℃烘至恒重,用高速万能粉碎机磨粉，用以测定淀粉含量。另一部分样品经液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱，用于提取RNA以测定淀粉合成相关酶基因表达量。成熟期考种，并测定成熟期淀粉含量。

1.2 淀粉合成相关酶基因表达量测定

总RNA提取采用TaKaRa试剂盒并按照说明进行。cDNA的合成采用TaKaRa公司生产的反转录试剂盒并参照操作说明进行。反转录于37 ℃恒温15 min，85 ℃灭活5 s。所合成的 cDNA置于-20 ℃保存。

利用primer 5.0软件设计淀粉合成相关酶基因引物(表1)，由北京华大基因有限公司合成。小麦β-actin基因(GeneBank accession number AB181991)作为内参基因。每对引物的扩增产物都要被克隆和测序确保引物的特异性。内参基因引物：5′-AAACGAAGGATAGCATGAGGAAG C-3′(正向引物),5′-AGCGGTCGAACAACTG GTA-3′(反向引物)。

表1 测定基因及其引物

采取实时荧光定量PCR参照 StepOnePlusTM.Real-Time PCR System试剂盒说明进行扩增。应用ABI PRISM@7300型荧光定量PCR仪，使用两步法PCR反应程序。采用2-ΔΔCt法计算各基因相关表达量。

1.3 淀粉含量测定

采用双波长法[12]测定小麦籽粒直链、支链淀粉含量,两者之和为总淀粉含量。

1.4 数据分析

采用Excel 2007和SPSS 21.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 高温与干旱对小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达的影响

2.1.1 对AGPase同工酶基因表达的影响

如图1所示，随时间推移，对照(CK)条件下的5个被测AGPase同工酶基因的表达均呈单峰曲线变化趋势，于花后14 d达到峰值，之后快速下降。高温(HT)条件下，AGPS1-b、AGPS2、AGPL2表达趋势与对照一致，而AGPL1、AGPS1-a呈持续下降趋势。干旱(DS)条件下，AGPL1、AGPL2、AGPS1-a和AGPS1-b的表达趋势与对照基本一致，其中，AGPS1-b的峰值推迟到至花后18 d出现，而AGPS2整体呈下降趋势。高温与干旱胁迫(HT+DS)处理下，AGPL1、AGPL1、AGPS2表达呈下降趋势，而AGPS1-a和AGPS1-b表达趋势与CK一致。HT+DS处理下不同AGPase同工酶基因的表达趋势与单因素胁迫处理不完全一致，推测两者之间存在互作效应。与对照比较，DS处理使AGPL1、AGPS1-a和AGPS1-b的相对表达量提高，而使AGPL2和AGPS2表达量下降；HT和HT+DS使AGPase的5个同工酶基因表达量均下降。

图1 不同处理AGPase同工酶基因表达的变化

2.1.2 对GBSS同工酶基因表达的影响

GBSS主要是参与直链淀粉合成的酶，有GBSSI和GBSSII两个同工酶基因。GBSSI在直链淀粉合成中起主要作用。

如图2所示，除HT+DS外，其他处理下GBSSI的相对表达量呈单峰曲线变化趋势，在花后22 d达到峰值，之后迅速下降，至灌浆后期趋于平稳。HT+DS处理下GBSSI的相对表达量整体呈下降趋势。CK和DS处理下，GBSSII的相对表达量整体呈双峰曲线变化趋势，分别在花后14 d和26 d出现峰值，DS处理GBSSII的表达量整体较高。HT处理GBSSII的相对表达量整体呈下降的趋势，且明显低于其他处理。HT+DS下，GBSSII的表达量在花后22 d之前与CK差异较小，且在大多时间高于CK，22 d之后开始急速下降，至花后26 d时明显低于CK。

图2 不同处理GBSS同工酶基因表达的变化

2.1.3 对SSS同工酶基因表达的影响

如图3，对SSI来说，CK、DS、HT及其复合胁迫处理的相对表达量均呈单峰曲线变化，于花后14 d达最大值。较对照而言，DS提高了SSI基因的相对表达量(花后30 d除外)，平均是对照的1.26倍；HT降低了SSI的相对表达量，平均比对照减少21.22%。花后10～18 d，HT+DS处理的SSI相对表达量高于对照，之后迅速下降低于对照。CK和DS处理的SSIIa和SSIIIa表达量表现为单峰曲线，DS处理一定程度上提高了这两个基因的表达量；而HT和HT+DS均导致SSIIa和SSIIIa表达量下降。不同处理的SSIIb和SSIV表达亦呈现单峰曲线，在花后 22～30 d分别出现最大表达量，HT+DS处理时表达量峰值出现时间比对照提前了4～8 d，且峰值降低；DS、HT和HT+DS处理基因表达量在峰值出现之前高于对照，之后迅速下降，低于对照。花后10～26 d，DS处理SSIIIb相对表达量高于CK，之后迅速下降，低于CK；高温降低了SSIIIb相对表达量，其中HT+DS下降幅度最大，体现出高温与干旱双重胁迫的叠加效应。DS整体上提高了SSIIc的相对表达量，而HT导致不同时期SSIIc表达量下降，HT+DS处理花后22 d开始才低于对照。

图3 不同处理SSS同工酶基因表达的变化

2.1.4 对SBE同工酶基因的影响

如图4，BEI的相对表达量呈单峰曲线变化趋势，DS提高不同时期BEI的表达量；而HT处理于峰值前提高其表达量，之后使其迅速下降至低于对照。DS处理对BEIIa的影响较小，提高了不同时期BEIIb的表达量；HT处理降低了BEIIa和BEIIb的相对表达量。BEIII表达亦呈单峰曲线，DS、HT和HT+DS分别使表达量峰值出现时间比对照提前8 d、4 d和8 d，在峰值出现之前，胁迫处理提高了其表达量，之后使其迅速下降至低于对照。

图4 不同处理SBE同工酶基因表达的变化

2.1.5 对DBE同工酶基因的影响

如图5所示，HT与DS条件下，ISA1相对表达量均低于对照。HT处理降低了ISA2的表达量，而DS和HT+DS处理的ISA2基因表达量高于CK。DS处理提高PUL相对表达量，HT提高了胁迫初期(花后10～18 d)PUL表达量，而之后降低其表达量。

图5 不同处理籽粒DBE同工酶基因表达的变化

2.1.6 对PHO同工酶基因的影响

如图6，HT与DS条件下，PHOL的相对表达量下降。PHOH表达量呈现单峰曲线变化趋势，HT与DS处理峰值出现时间比CK提前4 d，HT和HT+DS在峰值出现之前高于CK，之后迅速下降至低于CK，DS整体上提高了PHOH相对表达量。

图6 不同处理籽粒PHO同工酶基因表达的变化

2.2 高温与干旱对小麦籽粒淀粉及其组分含量的影响

HT和DS处理均显著降低了成熟期小麦籽粒直链、支链和总淀粉含量(表2)。与CK相比，DS、HT和HT+DS处理下直链淀粉含量分别下降4.2%、10.2%和14.9%，支链淀粉含量分别下降6.0%、13.4%和18.7%，总淀粉含量分别下降 5.6%、12.7%和17.8%。HT与DS条件下，支链淀粉下降幅度较大，导致直/支比值升高，DS、HT和HT+DS处理较CK分别升高1.9%、3.7%和4.6%。不同处理间比较，HT对淀粉含量的影响大于DS，HT+DS胁迫的影响大于单一因子胁迫，表现出显著的叠加效应。

表2 不同处理成熟期小麦籽粒淀粉及其组分含量的差异

2.3 小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达与支、直链淀粉和总淀粉含量的相关性

小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达与淀粉及其组分含量关系密切。在大部分测定时期，被测基因表达量与支链淀粉和总淀粉含量显著或极显著相关(表3)。如AGPS1-a、SSIIIa表达量与支链淀粉和总淀分含量显著或极显著相关(除花后22 d)；AGPS1-b、AGPL2表达量与支链淀粉和总淀粉含量显著或极显著相关(除花后14 d)；SSIIIb表达量与支链淀粉和总淀分含量均显著或极显著相关；BEI、BEIIa表达量与支、直链及总淀粉含量显著或极显著相关(除花后22 d与直链淀粉不显著)。总的来说，基因表达量与支链淀粉和总淀粉含量的关系比直链淀粉更密切。

表3 淀粉合成相关酶基因表达量与支、直链淀粉和总淀粉含量的相关分析

3 讨 论

小麦籽粒灌浆阶段的适宜温度为20～24 ℃，超过30 ℃的高温会使淀粉含量下降[13-14]。关于高温胁迫下籽粒淀粉合成酶基因表达的研究报道较少，尤其是高温与干旱复合胁迫条件下，有关全部淀粉合成相关酶基因表达的研究鲜有报道。有研究表明，GBSSI、AGPase1、SSIII和SBEI的表达量在花后12～18 d达到峰值[15-16]，高温会降低AGPase、SSS、GBSS和SBE的转录水平[3]，高温(35 ℃，花后5～7 d)使淀粉合成相关酶基因AGPS1-a、GBSSI、SSSIIIa、SBEI的表达量降低[4]。本研究发现，高温导致不同时期或胁迫后期的23个淀粉合成相关酶基因表达量不同程度的降低。高温条件下，AGPS1、AGPS2、AGPL1、AGPL2、GBSSI、SSI、SSIIa、SSIIIb、SBEI和SBEIIa下调表达，此结果与先前的研究一致[3,5]。有研究表明，AGPase、SSS和SBE可能在转录水平调控籽粒淀粉的合成，而GBSSI则在转录后调控。本试验条件下，高温抑制GBSS的表达，干旱提高GBSSI表达，而高温与干旱对直链淀粉的影响很小。同时，本研究发现，高温与干旱条件下，小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达模式发生变化，例如，SSIIa和BEIIa在对照中呈单峰曲线变化趋势，在高温处理中则呈整体下降趋势；高温与干旱处理中SSIIb、SSIV、BEIII表达量峰值出现时间比对照提前4～8 d，且峰值有不同程度下降。说明高温与干旱加快了淀粉合成相关酶基因的表达速率，但降低了其表达量，导致淀粉积累时间缩短、积累量的减少。高温与干旱均导致成熟期籽粒直链、支链和总淀粉含量下降，对支链淀粉的影响比直链淀粉大。小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达与支链和总淀粉含量关系密切。高温与干旱胁迫主要影响支链淀粉的合成与积累，对直链淀粉的影响较小。高温与干旱改变小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达是小麦籽粒淀粉积累受抑的主要原因，最终导致籽粒淀粉含量及产量下降。