美味牛肝菌液体发酵培养基的优化

纪纯阳

（辽宁省杨树研究所，辽宁营口115213）

美味牛肝菌（Boletus edulis）为牛肝菌科（Boletaceae）中的一种[1]，也是一种食药兼用经济价值较高的真菌，全国各地均有分布[2]。美味牛肝菌含有丰富的蛋白质和脂肪，人体必需的多种氨基酸、维生素及微量元素，有防病治病、强身健体的功效[3]。液体培养菌丝体生长快，生产周期短，易于大规模工业化生产，菌丝体在保健食品开发或提取多糖等方面具有很好的应用前景[4，5]。目前国内的大多数研究主要集中在对牛肝菌多糖的发酵、提取和生物活性物质开发等方面，但这些研究都是以液体发酵培养菌丝为基础，因此笔者进行了美味牛肝菌液体发酵培养基的优化研究，以期为美味牛肝菌的生产及其食（药）用价值的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）试验菌株：美味牛肝菌，购自中国微生物研究所菌种保藏中心，编号5.504。

（2）基础发酵培养基为葡萄糖5 g，麦芽糖22 g，酵母膏14 g，硫酸铵2.7 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸亚铁67 mg，硫酸铜100 μg，加蒸馏水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的平板培养[6-7]

在基础培养基中加入20 g/L的琼脂即得到固体培养基，将分离的美味牛肝菌菌株用打孔器（直径10 mm）打孔，将获得菌丝碟接种于固体培养基上，待菌丝长满整个培养基面时放于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 液体发酵培养[8，9，10]

选取菌丝生长均匀的平皿，用无菌打孔器（直径10 mm）打孔，无菌镊子夹取一片菌丝碟接种于盛有100 mL 发酵培养基的三角瓶中，28 ℃，160 r/min摇床发酵培养。分别测定每天菌丝干重：用漏斗过滤发酵液，保留的菌丝于40 ℃的烘箱中烘干称重，即为菌丝的干重。以发酵时间为横坐标，菌丝干重为纵坐标作生长曲线。

1.2.3 美味牛肝菌摇床发酵培养基的优化

1.2.3.1 单因素试验[11-12]

碳源：分别用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米粉作培养基中的碳源，使含碳量同基础发酵培养基，其余成分不变。

氮源：分别用硫酸铵、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、黄豆粉和尿素作培养基中的氮源，使含氮量同基础发酵培养基，其余成分不变。

无机盐：基础发酵培养基，加入不同浓度的磷酸二氢钾，使其浓度（g/L）依次为：0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1，其余成分不变。

由于基础发酵培养基中的硫酸亚铁和硫酸铜含量较少，不做分析。发酵培养条件为培养温度28 ℃，摇床转数170 r/min，pH4.1，装液量100 mL。

每个试验4次重复。液体发酵培养至菌丝量最大的时期，测其发酵液中美味牛肝菌菌丝干重。采用DPS18.10高级版软件，LSD法进行数据分析。

1.2.3.2 正交试验[13-14]

在单因素试验基础上，选择对美味牛肝菌生长影响显著的三组碳源、氮源与三个水平的磷酸二氢钾进行正交试验，试验因素水平设计见表1。

2 结果与分析

2.1 美味牛肝菌发酵培养菌丝生长曲线[15]

由图1 可以看出，供试美味牛肝菌菌株液体发酵培养2 d菌丝进入对数生长期，5 d达到最高峰，之后进入稳定期，持续1 d 后进入衰老期，因此5 d 是美味牛肝菌菌丝最佳的培养时间。

图1 美味牛肝菌液体发酵菌丝生长曲线

2.2 美味牛肝菌发酵培养基优化结果[16，17，18]

2.2.1 供试碳源对美味牛肝菌菌丝生长的影响

图2 试验碳源对美味牛肝菌菌丝生长的影响

由图2 可见，试验7 种碳源均可被美味牛肝菌菌丝利用，以葡萄糖+麦芽糖混合碳源，菌丝干重最高（6.118 g/L），其次为蔗糖、葡萄糖，而乳糖作为碳源菌丝干重最低（4.498 g/L）。

2.2.2 供试氮源对美味牛肝菌菌丝生长的影响

由图3 可见，试验7 种氮源均能被美味牛肝菌菌丝利用，但菌丝干重有明显差异，其中以黄豆粉作为氮源时菌丝干重最高（5.905 g/L），其次是酵母膏、酵母膏＋硫酸铵，而用尿素作为氮源菌丝干重最少（4.798 g/L）。

图3 试验氮源对美味牛肝菌菌丝生长的影响

2.2.3 KH2PO4含量对美味牛肝菌菌丝生长的影响

图4 KH2PO4含量对美味牛肝菌菌丝生长的影响

由图4 可见，当培养基中KH2PO4含量低于0.5 g/L 时，菌丝干重随着KH2PO4含量上升而增加，KH2PO4含量为0.5 g/L 时菌丝干重最高，为5.608 g/L。之后随着KH2PO4含量的增加菌丝干重反而降低。

2.2.4 正交试验结果

表2 液体培养基正交试验结果的极差分析

由表2 可知，各因素对美味牛肝菌菌丝干重的影响程度依次为B＞C＞A，最佳组合为A1B2C2，即选用葡萄糖＋麦芽糖作为碳源、酵母膏＋硫酸铵作为氮源、0.5 g/L 磷酸二氢钾作为无机盐。培养基中氮源的含量对美味牛肝菌菌丝生长影响最大。

3 小结与讨论

单因素及正交试验结果，美味牛肝菌发酵最佳培养基配方为：葡萄糖5 g/L，麦芽糖22 g/L，酵母膏14 g/L，硫酸铵2.7 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸亚铁67 mg/L，硫酸铜100 μg/L。通过验证试验在此条件下的菌丝干重为6.214 g/L。

试验最大的特点是选用组合的碳源及氮源，更利于美味牛肝菌菌丝的生长。组合碳源为葡萄糖+麦芽糖。葡萄糖是一种速效碳源，能够被菌丝体直接利用，缩短菌丝生长延滞期的时间，但其组成成分较单一，不利于菌丝体在对数期的生长和大规模生产；麦芽糖是一种二糖，只有在菌丝体分泌的胞外酶的作用下降解成单糖时，才能被利用，有利于菌丝的对数生长。氮源是构成菌丝体氨基酸、蛋白质、核酸的重要物质，通常所用的氮源可分为有机氮和无机氮两类。大部分真菌能很好地利用有机氮，吸收少量的无机氮。试验采用酵母膏＋硫酸铵作为氮源更利于菌丝的生长。真菌菌丝生长需要少量的无机盐、微量元素，有的是细胞的重要组成成分，有的在调节细胞膜透性和酶活性方面起重要的作用。

培养基的组成和配比合适与否，对微生物生长，生物产量及其活性成分提炼工艺的选择及质量都会产生相当大的影响。试验获得了美味牛肝菌液体发酵培养基，为美味牛肝菌驯化栽培及其开发提供一定的理论基础。