酶法自茶叶中提取茶多酚工艺和口味研究

李映　陈佳芸　吴亚楠　闻雪畅　葛喜珍

[摘 要]目的：探讨酶法对茶叶和茶叶渣中茶多酚提取效果及口味的影响。方法：设计单因素及正交试验，使用纤维素酶和果胶酶酶解茶叶和茶叶渣，紫外分光光度法和HPLC法检测茶多酚含量，HPLC法检测氨基酸含量，评价提取液口味。结果：酶法提取最佳条件为复合酶用量2.4%，料液比1∶10 g/mL，酶解pH 5.6，提取溫度60 ℃，提取时间75 min。酶法自茶叶和茶叶渣提取茶多酚产率分别为23.36%、10.38%，与不加酶相比分别提高55.94%、15.46%;酶法自茶叶和茶叶渣提取氨基酸产率分别为4.98%、3.12%，与不加酶相比分别提高20.42%、25.32%;茶叶加酶处理得到氨基酸含量高、收敛强度和苦味弱，总体接受度与氨基酸含量一致。结论：酶法可高效提取茶叶有效成分，茶叶渣可作为原料提取茶多酚，用于食品工业。

[关键词]茶叶;茶叶渣;茶多酚;口味

[中图分类号]TS 272[文献标志码]A[文章编号]1005-0310（2020）03-0077-06

0 引言

作为世界三大饮品之一，茶叶具有较高的营养和药用价值。茶叶富含茶多酚、氨基酸、多糖、维生素等物质。茶多酚有抗癌、抗衰老、降血糖、抗辐射等作用;氨基酸具有鲜味，如酸、甜等[1-2]。茶多酚和氨基酸普遍用于食品加工行业。茶叶中茶多酚的提取方法包括溶剂萃取法、超声波提取法、微波提取法、离子沉淀法、树脂吸附法和酶法等，其中酶法提取安全、温和、环保、效率高、简洁[3]。本研究基于酶法从茶叶和茶叶渣中提取茶多酚和氨基酸，并检测其味质，探讨酶法提取对茶多酚、氨基酸和提取物口味的影响，以及探究自茶叶或茶叶渣中提取茶多酚的高效、环保生产工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料：绿茶购自山东日照天润茶业有限公司，茶叶渣（用100 ℃水浸泡茶叶30 min，连续冲泡3遍，烘干茶叶，得茶叶渣）;纤维素酶（400 U/mg）、果胶酶（500 U/mg）由上海瑞永生物科技有限公司提供;乙醇、茚三酮、氯化亚锡、硫酸亚铁、酒石酸钾钠（北京化工厂，分析纯）;磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（北京益利精细化学品有限公司，分析纯）;标准品：表儿茶素没食子酸酯（ECG）标准品、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）标准品、表儿茶素（EC）标准品、没食子酸（GA）标准品、标准氨基酸（异亮氨酸）均购自国家标准物质中心;咖啡碱（CAF）标准品购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 仪器设备

分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）;LC-16高效液相色谱仪（岛津仪器（苏州）有限公司）;Waters 2695 高效液相色谱仪（Empower 工作站）;PHS-3CpH计（上海精密科学仪器有限公司）;JM-A6002电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司）;HCP-500 A高速多功能粉碎机（浙江省永康市金穗机械制造厂）;TG16台式高速离心机（长沙英泰仪器有限公司）。

1.3 茶多酚提取工艺

取茶叶或茶叶渣，将复合酶溶液加入茶叶或茶叶渣、酶解;加乙醇溶液提取，提取物过滤，离心，得上清液;检测上清液中茶多酚和氨基酸含量，计算茶多酚和氨基酸提取率，同时评估口味。

1.4 单因素试验

1.4.1 酶用量（复合酶占茶叶质量百分比）筛选

配制复合酶水溶液（根据预试结果纤维素酶、果胶酶各2.0 mg/mL）。称取茶叶1.0 g于三角瓶，加入复合酶溶液（1.2%、2.4%、3.6%、4.8%、6.0%），加水至60 mL，调pH=5.4，温度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇至100 mL，50 ℃提取60 min，探讨不同酶用量对茶叶中茶多酚提取率的影响。

1.4.2 料液比（茶叶质量与提取剂体积比）筛选

称取茶叶1.0 g于三角瓶，加1.2%的复合酶，加水至60 mL，调pH=5.4，温度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇（料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL），50 ℃提取60 min，探讨不同料液比对茶叶中茶多酚提取率的影响。

1.4.3 酶解pH筛选

称取茶叶1.0 g于三角瓶，复合酶用量1.2%，加水至60 mL，调pH（3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8），温度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇至100 mL，50 ℃提取60 min，料液比为1∶10 g/mL，探讨不同pH对茶叶中茶多酚提取率的影响。

1.4.4 提取温度筛选

称取茶叶1.0 g于三角瓶，复合酶用量1.2%，加水至60 mL，酶解pH为5.4，酶解300 min。加75%乙醇，50 ℃提取60 min，料液比为1∶10 g/mL，探讨不同提取温度（30、40、50、60、70、80 ℃）对茶叶中茶多酚提取率的影响。

1.4.5 提取时间筛选

称取茶叶1.0 g于三角瓶，复合酶用量1.2%，加水至60 mL，酶解pH为5.4，酶解300 min。加75%乙醇，50 ℃，料液比为1∶10 g/mL，探讨不同提取时间（15、30、45、60、75、90 min）对茶叶中茶多酚提取率的影响。

1.5 正交试验

根据单因素试验结果，进行4因素3水平的L9（3）4正交设计试验。分别以茶叶和茶叶渣为原料，以复合酶用量（A）、料液比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）为因素，以茶多酚提取率为指标，利用Latin正交试验设计软件进行数据分析，建立酶法自茶叶、茶叶渣中提取茶多酚的最优工艺参数，见表1。

1.6 验证试验

以不加酶为对照，分别用茶叶和茶叶渣为底物，利用正交试验所得最佳条件提取茶多酚和氨基酸，用酒石酸亚铁比色法和高效液相色谱法测定茶多酚提取率，高效液相色谱法测定氨基酸含量。

1.6.1 茶叶中茶多酚含量测定

将提取液冷却至室温，过滤，取滤液，3 600 r/min离心10 min，取上清，根据国标GB/T 8313—2002《茶 茶多酚测定》中的酒石酸亚铁比色法来测定提取液中茶多酚含量。精确吸取1 mL待测液于25 mL容量瓶，加入5 mL酒石酸亞铁溶液和4 mL蒸馏水，混合摇匀，再滴加pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液定容，以空白溶液作参比，在540 nm的波长下测量吸光度A。

1.6.2 儿茶素和咖啡碱含量检测

对照品制备：分别称量表儿茶素没食子酸酯（ECG）标准品、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子酸（GA）、咖啡碱（CAF）标准品，用三蒸水定容。ECG、EGCG和CAF的质量浓度均为2 mg/mL，GA质量浓度 0.1 mg/mL，备用。儿茶素和咖啡碱用高效液相色谱法（HPLC）测定：ZORBAX SB-C18 ODS色谱柱，5 μm，4.6 mm×150 mm，柱温：35 ℃，流动相为30%甲醇加0.5‰ H3PO4;进样量：10 μL，流动相流速1 mL/min，紫外检测器λ=284 nm。供试茶叶或茶叶渣提取液，冷却至室温，过滤，滤去反应体系中的茶粉或茶渣，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，待测。

1.6.3 氨基酸含量检测

氨基酸组分含量测定参考尹军峰等方法[4]。采用Waters 高效液相色谱仪检测，Empower 软件工作站， Agilent G1 321 A荧光检测器，激发波长（Ex）：250 nm，发射波长（Em）：395 nm，AccQ-Tag 氨基酸（15 mm×3.9 mm×4.6 mm），流速：1 mL/min，柱温：27 ℃，进样量：10 μL，流动相A（乙腈∶水=60∶40），流动相B（乙腈∶磷酸盐缓冲液=10∶90，0.013 mol/L的磷酸盐缓冲液pH 8.1），检测波长： 360 nm。梯度洗脱（0～2 min，A∶B=0∶100;2～15 min，A∶B=20∶80;15～30 min，A∶B=30∶70;30～40 min，A∶B=80∶20;40～45 min，A∶B=100∶0），用外标法定量氨基酸组成的含量。

1.6.4 茶多酚提取率计算

茶多酚提取率用茶叶干物质的质量百分比表示，根据国标GB/T 8313—2002《茶 茶多酚测定》中的酒石酸亚铁比色法，用以下公式计算：

茶多酚提取率=A×1.957 ×21 000×L1L2×M×m×100%。

其中，L1为试液的总量（mL）;L2为测定时的用液量（mL）;M为试样的质量（g）;m为试样的干物质含量（%）;A为吸光度。

1.7 口味评定

口味评估由7位训练有素的专家（男4名，女3名，35～56岁）组成，样品在室温（约25°C）下提供，每个小组成员对口味属性（苦味、收敛性、鲜味和接受程度）进行评分。采用十分制，其中8～10为“极强”，6～8为“强”，4～6为“中性”，2～4为“弱”，0～2为“极弱”。对结果进行统计分析，确定不同样本得分差异，每个评估在不同的日期重复3次[5]。

2 试验结果及分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶用量对茶多酚提取率的影响

由图1可知，复合酶含量在0～1.2%范围，底物和酶充分接触，随酶量增加茶多酚提取率提高;当复合酶用量大于1.2%时，茶多酚提取率下降，推测复合酶饱和后，酶解反应效率下降，故复合酶添加量以1.2%为宜。

2.1.2 料液比对茶多酚提取率的影响

由图2可知，当料液比在1∶6～1∶10 g/mL时，有助于茶多酚向溶剂转移，当料液比超过 1∶10 g/mL时，溶剂用量增加，浸出物被稀释，后续浓缩、干燥成本增加，故最佳料液比为1∶10 g/mL。

2.1.3 酶解pH对茶多酚提取率的影响

由图3可知，随酶解pH增加，茶多酚提取率先升后降，复合酶pH值为5.6时酶解作用最强，当pH偏离最佳值时，酶活中心的部分基团离子发生变化，酶活性减弱;当pH大大偏离最佳值时，酶蛋白结构改变、变性失活，茶多酚提取率随之降低。

2.1.4 提取温度对茶多酚提取率的影响

由图4可知，随酶解温度升高，茶多酚的提取率增高，适当升温能有效破坏细胞壁，促进胞内物质渗出，当温度达50 ℃后，继续升温，酶失活，故最佳酶解温度为50 ℃。

2.1.5 提取时间对茶多酚提取率的影响

由图5可知，在30～90 min范围内，随提取时间延长，茶多酚提取率提高，提取60 min后，茶多酚含量增加偏缓，提取时间太长，茶叶中有效成分可能会发生转化，一些酶解产物例如酚类、单宁、花色素，可成为纤维素酶的抑制剂，且随提取时间延长，提取成本增加，适宜的提取时间为60 min。

2.2 正交试验方案与结果

正交试验结果见表2，正交试验数据分析见表3。

据正交结果，各因素影响茶多酚得率的主次排列如下：料液比 B>提取时间 D>提取温度 C>酶用量A，最佳组合为A2B2C2D3，即复合酶用量2.4%，料液比1∶10 g/mL，提取温度60 ℃，提取时间75 min。

2.3 验证试验

2.3.1 不同提取方法对游离氨基酸和茶多酚提取率的影响

由表4可知，在茶叶或茶叶渣提取体系中加入复合酶，采用最佳工艺参数提取，茶多酚提取率分别为23.36%、10.38%，与不加复合酶比较，分别提高55.94%、15.46%;氨基酸提取率分别为4.98%、3.12%，与不加复合酶比较，分别提高20.42%和25.32%。

2.3.2 提取液中儿茶素及咖啡碱含量

表5高效液相色谱（HPLC）检测结果表明，与茶叶或茶叶渣不加酶比较，用复合酶酶解，表儿茶素没食子酸酯（ECG增加12.13%、3.70%）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG增加10.69%、2.42%）、咖啡碱（CAF增加8.31%、4.35%）的提取量均有不同程度的增加，且酶解未发现有新成分。色谱未检测到没食子酸（GA）。另外，茶叶经开水浸泡后茶叶渣中尚含大量茶多酚，通过酶法提取可以将其中的有效成分提取，避免资源浪费。

2.4 不同处理对提取液口味的影响

由表4、图6看出，茶叶加酶处理游离氨基酸含量最高，其他依次是茶叶不加酶、茶叶渣加酶、茶叶渣不加酶;总体接受度同游离氨基酸含量一致，即氨基酸含量越高被接受程度越高;收敛强度和苦味由强到弱依次是：茶叶渣不加酶、茶叶渣加酶、茶叶不加酶和茶叶加酶。

3 讨论与结论

茶多酚的溶剂萃取法纯化难度大;超声波提取利用超声波与媒介物质互相作用，发生机械及空穴作用，破坏茶叶细胞壁，加速细胞中活性物质的溶出，其缺点是设备费用高[6];微波提取利用不同物质在微波场中吸收微波能力不同，待提取成分被选择性加热时，与提取体系分离，进入吸收微波能力较差的提取剂中，提取成本高;离子沉淀法利用茶多酚与一些重金属离子发生络合形成沉淀，将金属离子作沉淀剂，从混合物中分离纯化得高纯度茶多酚，此法重金属可对产品造成二次污染;树脂吸附法利用树脂选择性吸附茶多酚成本高、费时费力[7]。本研究表明，酶法自茶叶或茶叶渣中提取茶多酚的提取率比不加酶分别提高55.94%和15.46%，HPLC法检测结果，茶多酚提取率较比色法提高幅度小，因茶多酚的主要成分是黄烷酮类、花色素类、黄酮醇类、花白素类和酚酸及缩酚酸类化合物，其中黄烷酮类（儿茶素类化合物）占茶多酚总量的60%～80%，其次是黄酮类、酚类。茶多酚是混合物，儿茶素是其中的一类物质，高效液相色谱法测定儿茶素虽能反映茶多酚的提取率高低，但不能完全检测茶多酚中所有成分的变化，从总趋势推断，纤维素酶和果胶酶作为复合酶浸提茶多酚是一种有效的提取方式[3]。

结果表明，酶法提取儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、咖啡碱和游离氨基酸的含量均有不同程度的增加。儿茶素分酯型与非酯型，酯型儿茶素收敛性强，主要对茶汤苦涩味起作用，而非酯型儿茶素具有先苦后甜的滋味特征，口味甜[8]。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和咖啡碱（CAF）是苦味的主要贡献者;氨基酸类表现为酸、甜、苦、鲜4种特征，是鲜味和甘味的主要贡献者[9]，可缓解茶的苦涩味[10]。酶法提取氨基酸含量增加，口感清爽度高、總体可接受程度高。

以茶叶渣为底物提取茶多酚和氨基酸含量均比茶叶低，因热水冲泡，部分茶多酚和氨基酸溶出，研究表明热水冲泡后还有37.75%茶多酚、36.18%氨基酸保留在茶叶渣中，采用酶法提取，所得的茶多酚和氨基酸含量比对照（不用酶）分别高15.46%、25.32%，通过酶法可以将残留在茶叶渣的有效成分提取。与茶叶相比，茶叶渣酶法提取物感官收敛、涩味较浓，但化学成分无明显区别，茶叶渣可作为原料提取茶多酚，用于食品原料工业。

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（责任编辑 李亚青）