截叶铁扫帚中芦丁、槲皮素与山奈酚含量测定研究

董洪强，赵跃丽，张兰胜,2*

(1.大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671000；2.丽江师范高等专科学 校应用技术学院，云南 丽江 674199)

截叶铁扫帚(Lespedezacuneata(Dum. Cours.) G. Don)为豆科胡枝子属一年生草本植物，又名夜关门、千里光等，广泛分布于我国大部分省份，山坡、旷野地均有生长，全草入药。截叶铁扫帚在我国有着悠久的用药历史，《滇南本草》中就有记载，具有止咳平喘、清热利湿等功效，常用于治疗慢性气管炎、疳积、糖尿病、脾虚腹泻及脱肛等疾病[1-2]。以截叶铁扫帚为主要原料的贵州董酒系列产品等，一直得到消费者的青睐[3]。截叶铁扫帚的化学成分复杂多样，主要为黄酮类、酚酸类、木脂素类等[4-7]。黄酮类化合物在植物界中分布广泛，除了抗氧化、抗菌、降脂作用外，还有保肝、抗肿瘤、抗肺纤维化等多种生理活性，受到国内外的高度重视，研究进展很快[8-10]。目前，对截叶铁扫帚中黄酮类化合物的相关研究不多，本试验采用RP-HPLC法同时测定截叶铁扫帚中芦丁、槲皮素、山奈酚三种黄酮类成分含量，这对于截叶铁扫帚质量控制方法的制定有指导意义。

1 材料与仪器

1.1 材料

截叶铁扫帚样品采自大理州洱源县茈碧湖镇丰源村，由大理大学药学与化学学院姜北教授鉴定为豆科植物截叶铁扫帚Lespedezacuneata(Dum. Cours.) G. Don。

1.2 仪器与试剂

试验使用的主要仪器见表1。芦丁对照品(批号：100080201610)、槲皮素对照品(批号：100081201610)、山奈酚对照品(批号：110861201611)均购自中国食品药品检定研究院。水为自制超纯水，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

表1 实验使用的主要仪器

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱条件色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：甲醇(A)- 0.4%磷酸(B)溶液，梯度洗脱(0～35 min，0%→30% A；36～90 min，30%→55% A)，流速：0.7 mL/min，进样量：16 μL，柱温：35℃，检测波长：371 nm。在该色谱条件下，芦丁、槲皮素、山奈酚的保留时间分别是29.08、46.48和48.88 min；RSD值分别是1.20%、1.43%和0.60%，试验结果表明色谱峰与其他杂质峰有很好的分度(分离度R均小于1.50%)，且都达到基线分离，结果见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁、槲皮素、山奈酚对照品2.1、5.2和1.9 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并定容，使其浓度分别为0.21、0.52和0.19 mg/mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为混合对照品储备液。分别精密吸取芦丁、槲皮素、山奈酚0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL，置10 mL的容量瓶中，然后用甲醇稀释到刻度线，摇匀，得到混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

于锥形瓶中精密称定约1.0 g截叶铁扫帚药材粉末，准确加入25 mL甲醇，超声处理60 min(功率：500 W，频率：30 kHz)，取出放冷，再次称量，用甲醇补足损失的质量，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2项下混合对照品溶液，按2.1色谱条件进样16 μL，然后测定其峰面积。以横坐标X表示对照品进样量，以纵坐标Y表示峰面积进行回归分析。芦丁、槲皮素、山奈酚的回归方程分别为：Y=644.44X+89.611(r=0.999 3)、Y=6 241.1X-189.69(r=0.999 6)、Y=5 733.7X+5.573 3(r=0.999 3)，芦丁在0.108～1.681 μg有良好的线性关系，槲皮素在0.204～4.083 μg有良好的线性关系，山奈酚在0.072～1.440 μg有良好的线性关系，结果见表2。

表2 芦丁、槲皮素、山奈酚的回归方程、相关系数和线性范围

2.5 精密度试验

取2.2项下混合对照品溶液，按2.1色谱条件重复进样6次，进样量16 μl，测定。结果芦丁、槲皮素、山奈酚的峰面积RSD分别为0.49%、0.39%、0.22%，结果表明精密度好。

2.6 稳定性试验

取混合对照品溶液16 μl，按2.1色谱条件分别在0、2、4、6、8、10 h时测定其色谱峰面积。结果芦丁RSD为1.30%、槲皮素RSD为1.50%、山奈酚RSD为0.88%，表明10 h内芦丁、槲皮素和山奈酚稳定。

2.7 重复性试验

取6份截叶铁扫帚叶干燥粗粉，每份约1.0 g，按2.3项下方法制备样品溶液，进样16 μL，在上述色谱条件下测定。结果芦丁、槲皮素、山奈酚含量的RSD分别为1.62%，1.30%，0.96%，显示此方法重复性好。

2.8 加样回收试验

取约1.0 g已知芦丁、槲皮素、山奈酚含量的药材，共6份，精密称定，分别精密加入3种对照品溶液各1 mL。按上述样品制备方法制备，按上述色谱条件进行测定，每个样品重复6次，测定各加样样品中3种成分含量，算出芦丁、槲皮素、山奈酚的加样回收率，取其平均值。结果芦丁平均加样回收率为99.37%，槲皮素平均加样回收率为100.10%，山奈酚平均加样回收率为99.42%，RSD分别为1.70%、1.80%、0.79%，结果见表3。

表3 芦丁、槲皮素、山奈酚的加样回收率

续表3 芦丁、槲皮素、山奈酚的加样回收率

2.9 样品含量测定

按上述色谱条件和样品溶液制备方法，测定5批截叶铁扫帚样品中3种黄酮类化合物含量，结果见表4。

表4 截叶铁扫帚样品中芦丁、槲皮素、山奈酚含量

3 讨论

3.1 截叶铁扫帚的质量控制

截叶铁扫帚使用广泛，常用于治疗慢性气管炎、疳积、糖尿病、脾虚腹泻及脱肛等疾病，其中芦丁、槲皮素、山奈酚等黄酮类化合物是胡枝子属植物截叶铁扫帚的主要成分。截叶铁扫帚中槲皮素等黄酮类成分能有效抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞的增殖，具有抗糖尿病、肾病活性[11]；截叶铁扫帚50%乙醇提取物中总黄酮具有很强的抗氧化、清除自由基作用[12]。因此，研究截叶铁扫帚中黄酮类化合物的含量有助于探索其有效成分与疗效间的关系[13]。截叶铁扫帚作为一种应用前景广阔的中草药，若质量未能得到有效控制，将影响临床治疗效果，故需寻求有效检测方法以保证其质量。

3.2 样品溶液制备方法的选择

采用回流提取和超声提取两种不同的提取方法，比较甲醇提取截叶铁扫帚中芦丁、槲皮素、山奈酚的效率。结果显示，回流提取法提取芦丁、槲皮素、山奈酚的提取率分别为0.32、0.48、0.15 mg/g，超声提取法提取芦丁、槲皮素、山奈酚的提取率分别为0.41、0.52、0.12 mg/g，可见超声提取法的提取效率优于回流提取法，故本试验采用超声提取法。

3.3 流动相的选择

试验过程中考察了乙腈-0.4%磷酸、甲醇-0.4%磷酸、甲醇-0.2%磷酸等系统。结果发现采用甲醇-0.2%磷酸系统，3种黄酮类成分能与杂质峰很好的分离，但峰形较差；乙腈-0.4%磷酸作为流动相系统时，出峰较快且峰形较好，但3种黄酮类成分与杂质峰不能很好的分离；甲醇-0.4%磷酸的流动相系统对3种黄酮类成分有较好的分离效果且峰形较好，故选择甲醇-0.4%磷酸作为流动相系统。采用不同比例的甲醇-0.4%磷酸洗脱并与梯度洗脱结合，发现甲醇-0.4%磷酸梯度洗脱(0～35 min，0%→30% A；36～90 min，30%→55% A)分离效果最佳，故以此作为流动相条件。

3.4 检测波长的选择

试验中对芦丁、槲皮素、山奈酚的紫外光谱最佳吸收波长进行了探索，考察了190～400 nm不同波长的吸收图谱，发现在371 nm处芦丁、槲皮素、山奈酚均具有很好的吸收图谱，且干扰小，分离效果好，故将371 nm作为检测波长。

综上所述，本试验建立的RP-HPLC法同时测定截叶铁扫帚中芦丁、槲皮素、山奈酚的含量，对评价截叶铁扫帚的质量具有参考意义，为截叶铁扫帚的进一步开发利用提供了科学依据。