无患子皂苷抗炎抗菌功效研究

雷发玲，肖 蕾，么春艳，王增利

(1.无限极中国有限公司，广东 新会 529156；2.浙江省医学科学院，浙江 杭州 310013；3.健士星生物技术研发(上海)有限公司，上海 200335)

无患子(Sapindusmukorossi)是无患子科无患子属落叶乔木，有木患子、油患子、洗手果等别称，主要分布于我国长江流域及其以南各省区，在日本、东南亚等地区也有分布[1]。民间常用无患子的根和果入药，其味苦微甘、微毒，具有清热解毒、化痰止咳等功效[2]。无患子中含有丰富的三萜类皂苷成分[3]，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗高血压、杀虫、减少土壤中重金属影响等多种活性[4-9]。此外无患子皂苷还是一种天然表面活性剂，具有良好的起泡性和去污性[10]，可用于美容护肤肥皂、洗发香波、洁肤护肤化妆品、日常洗涤以及餐具清洁产品中。无患子皂苷的特点使其在医药、化妆品及洗涤用品等方面具有广阔的应用前景。随着人们对自然的崇尚，天然抗菌剂和消炎剂的开发成为人们关注热点。本研究通过佛波酯(TPA)诱导的小鼠耳肿胀模型研究无患子皂苷的抗炎效果，并研究了无患子皂苷对环境常见致病菌的抑菌能力，为无患子皂苷作为天然抗炎剂和抗菌剂的开发应用提供理论依据。

1 试剂与仪器

1.1 材料与试剂

无患子药材来源于福建漳浦大山苗木场，本研究使用的部位为无患子假种皮，将无患子果实去核后烘干，粉碎，过40目筛备用。

动物：ICR小鼠，SPF级，由浙江省医学科学院实验动物中心提供(实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2014-0001)，共48只，体重为18±2 g，全部为雄性。实验动物于屏障系统下饲喂适应环境5～7 d，适应期结束时，体重25±2 g。

供试菌种：大肠杆菌(Escherichiacoli) ATCC8739；白色念珠菌(Moniliaalbicans)ATCC10231；黑曲霉(Aspergillusniger) ATCC16404；肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)CGMCC50760；肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC4352；乙型溶血链球菌(Streptococcushemolytis-β)ATCC21059；单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19114；须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)BNCC340405；球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum)CICC2505。

试剂：齐墩果酸(成都曼斯特生物科技有限公司)；乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)。佛波酯(TPA)、TNF-α、IL-6、IL-1β 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。培养基：MH培养基(酸水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉1.5 g，牛肉浸出粉2 g)；PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，氯霉素0.1 g)。

1.2 试验仪器

D101大孔树脂(上海摩速科学仪器有限公司)；R-210型旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；Eclipse ci显微镜(日本尼康)；DS-FI2显微成像系统(日本尼康)；Multiskan FC 型酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)；SW-CJ-1G型超净工作台(苏州净化设备有限公司)；DNP-9082 型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；ZDX-35SBI立式压力蒸气灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；WFZ UV-3802型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)。

2 方法

2.1 无患子总皂苷的制备

称取无患子假种皮粉末1 kg，使用70%乙醇进行提取，提取温度为60℃，料液比1∶9，提取次数为3次，时间分别为：3 h、3 h和2 h。提取结束后抽滤除去药渣，合并提取液，将提取液浓缩至无醇味，作为大孔树脂上样溶液进行上样，分别用水、30%、70% 醇依次洗脱，收集70%醇洗部位，浓缩至无醇味，即为无患子提取液。

无患子皂苷浓度的测定：配制1 mg/mL齐墩果酸-乙醇对照液10 mL，备用；配制5%香草醛-冰醋酸液10 mL，备用。分别取对照液20、40、60、80、100 μL，先后依次加入5%香草醛-冰醋酸液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，充分摇匀后于60℃水浴加热15 min，取出后立即冰水冷却3 min，加入5 mL冰醋酸，混匀，以不加对照液为空白组，在549 nm处测量吸光度，并根据结果绘制标准曲线。无患子提取液稀释100倍，取20 μL稀释液按上述过程操作测得其吸光度，根据标准曲线计算无患子粗提液皂苷浓度。

2.2 抗炎模型建立与给药方案

将 48只小鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、阳性对照组(地塞米松，2.5 mg/kg)和无患子低剂量组(10 mg/mL)、中剂量组(20 mg/mL)、高剂量组(40 mg/mL)，每组8只。除空白组外，其余各组小鼠均于右耳内外侧涂抹 20 μL TPA致炎。并于造模同时，各给药组小鼠均按每耳20 μL于右耳内外侧涂抹相应药液(以丙酮为溶剂)，空白组和模型组小鼠涂抹等体积丙酮溶液[11]。

2.3 小鼠耳肿胀程度的测定与病理切片

给药6 h后，用数字测厚仪测量每只实验动物左右耳的厚度，计算每只实验动物左右耳的厚度差[12]。之后，将耳组织取样并用 4%中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋，切成10 μm的薄片，进行苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察各组小鼠耳组织病理学变化。

2.4 耳组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量测定

分别取同一部位耳组织，称质量，按质量(g):体积(mL)= 1:9的比例加入生理盐水，在冰浴条件下剪碎组织，制成 10%组织匀浆，然后以3000 r/min离心10 min，收集上清液，采用 ELISA 法检测各组小鼠耳组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，具体操作按照相应试剂盒说明书进行。

2.5 供试菌种菌悬液制备

大肠杆菌、白色念珠菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血性链球菌、单增李斯特菌菌悬液的制备：取出菌种，复苏并划线于平板中，于37℃过夜培养。挑单菌落培养于液体 MH 培养基中(乙型溶血性链球菌接种于含5%去纤维绵羊血的MH培养基中)，于试验前生长至对数生长期。利用比浊法稀释制成108CFU/mL 的菌悬液，4℃备用。

黑曲霉、须癣毛癣菌、球孢枝孢霉菌悬液的制备：取出菌种，复苏并划线于PDA平板中，25℃培养 5～7d直至长出孢子。用PDA液体培养基将孢子洗下，血球计数板计数，得到105个/mL的孢子悬液，4℃备用。

2.6 最小抑菌浓度(MIC)测试

根据微量肉汤稀释法[13]进行，将待测无患子提取液用微孔滤膜过滤除菌，按照2倍稀释法将其用待测菌种的无菌液体培养基稀释成80～0.001 mg/mL的稀释液。取微量稀释板(96孔)，每孔加入50 μL不同浓度的稀释样品液和菌悬液50 μL，以不加样品液且含菌的100 μL培养基作为对照，每组做3个平行。大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血链球菌、单增李斯特菌在37 ℃条件下培养18～24 h，白色念珠菌在25℃条件下培养48 h，黑曲霉、须癣毛癣菌、球孢枝孢菌于25℃条件下培养7 d。观察96孔板每个浓度孔中测试菌的生长情况，与对照孔比较，菌的生长完全被抑制，培养基清亮所对应的最低药物浓度值为无患子皂苷的最小抑菌浓度值。

3 结果与分析

3.1 无患子提取液皂苷含量

经紫外分光光度法测定, 齐墩果酸标准溶液的标准曲线回归方程式为y=0.0073x-0.0189(R2=0.9991)。经检测，无患子皂苷提取液吸光度OD=0.2147。经计算，无患子提取液中皂苷含量为160 mg/mL。

3.2 无患子对小鼠耳肿胀程度的影响

小鼠的耳肿胀程度通过两耳之间的厚度差来表示，试验结果见表1。与空白对照组相比较，模型对照组的双耳厚度差显著升高(P<0.01)，说明TPA致小鼠耳肿胀模型造模成功；与模型对照组相比较，地塞米松组、低剂量组、中剂量组、高剂量组双耳厚度差均显著下降(P<0.01)，且三个剂量组呈线性下降，三个剂量组的下降幅度均小于阳性对照组。

表1 各组小鼠耳厚度测定结果

3.3 耳组织病理结果

与空白对照组相比较，模型对照组组织局部固有层可见轻中度水肿，结构疏松；局部固有层可见少量中性粒细胞浸润，少量皮质腺可见炎性细胞浸润。低剂量组组织局部固有层可见轻度水肿，结构疏松；固有层可见中性粒细胞散在浸润；局部可见肥大细胞散在浸润。中剂量组组织局部固有层可见轻度水肿，结构疏松；固有层可见中性粒细胞散在浸润，高剂量组组织无明显炎性细胞浸润；表皮、固有层形态结构正常。

图1 各组小鼠耳组织病理切片结果

3.4 耳组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量

各组实验动物耳组织中TNF-α、IL-6、IL-1β测定结果见表2。试验结果显示，与空白对照组比较，模型对照组 TNF-α、IL-6、IL-1β的含量明显升高；阳性对照药地塞米松可以显著降低TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，无患子皂苷各剂量组均可以显著降低TNF-α分泌(P<0.01)，中剂量组和高剂量组可以降低耳组织中IL-6的含量(P<0.05)；三个剂量组对炎症因子IL-1β无明显作用。

表2 各组小鼠耳组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较

3.5 无患子皂苷抑菌结果

由表3可知，无患子皂苷对除黑曲霉外的8种菌有较好的抑菌能力，在较低浓度下就可以抑制菌种生长。其中对须癣毛癣菌的抑菌能力最好，在浓度为0.005 mg/mL即可抑制该菌生长；其次为白色念珠菌，在1.25 mg/mL浓度时可抑制其生长；对黑曲霉的抑菌效果最差，需要在80 mg/mL时才有抑菌效果。

表3 无患子皂苷对供试菌的MIC值

4 讨论

炎症是机体对损伤因子所产生的正常防御反应，适度的炎症反应对人体是有益的，但严重的炎症则会导致自身损伤。在炎症中会产生各种促炎和抗炎中间体，炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β都在炎症的发生发展过程中扮演重要角色[14]。佛波酯(TPA)是巴豆油的主要活性成分，能够诱导小鼠耳组织角质形成细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症细胞因子[15]，其模型比较稳定，可广泛用于化合物或植物活性成分的抗炎活性评价。有研究表明，无患子皂苷对二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致小鼠足肿胀模型中具有抗炎活性[16]。在本研究中，我们选择了TPA致小鼠耳肿胀模型对无患子皂苷的抗炎活性进行研究，并初步考察了其作用机制。试验结果显示，阳性对照地塞米松和无患子皂苷进行局部治疗均显著降低了TPA引起的耳肿胀(P<0.01)，并降低了组织细胞中的炎性细胞浸润，表明无患子皂苷具有较好的抗炎作用。

TNF-α、IL-6 被认为是最重要的促炎细胞因子，其中TNF-α出现在炎症反应的最早阶段，能够激活中性粒细胞/淋巴细胞，促进其他多种炎症因子包括 IL-6的释放[17]；TNF-α还是与炎症严重程度有关的分子，也作为评价药物治疗作用高低的重要指标[18]；IL-6 能活化丝裂原活化蛋白激酶，进而激活转录激活因子促进炎症进程。IL-1β能促进免疫应答，参与炎症反应，增强NK细胞的杀伤力，刺激单核/巨噬细胞产生IL-2、IL-6等细胞因子[19]。在本试验中，无患子皂苷各剂量组均可以显著降低TNF-α分泌水平(P<0.01)，中剂量组和高剂量组可以降低耳组织中IL-6的含量(P<0.05)，但是无患子对炎症因子IL-1β无降低作用。综上，无患子皂苷具有抗炎作用，其机制可能与改善炎症细胞浸润与抑制炎症因子TNF-α、IL-6的表达有关，可以一定程度地抑制炎症引发的级联反应，从而缓解炎症反应发生的程度，进而防止进一步的组织损伤。

人们的居住环境中，室内空气、墙面、厨房、餐具等均有微生物分布，空气中的细菌和真菌种类则有数十至数百种之多[20]，致病菌可引起人体出现过敏性皮炎、过敏性肺炎、腹泻等危害人体健康的疾病。我们在试验中选择了家居环境中具有代表性的菌种，黑曲霉、枝孢菌为引起室内物品霉变和墙面发霉的常见霉菌；大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌为餐具、案板易污染的细菌菌种，容易引起呕吐、腹泻、急性肠胃炎等消化系统疾病；肺炎克雷伯菌和溶血链球菌是室内空气中常见的细菌，在人体免疫力低下的情况下会侵入人体引起相关疾病；白色念珠菌和须癣毛癣菌是人体皮肤表面分布的两种常见致病真菌。试验结果表明，无患子皂苷对除黑曲霉外的8种环境有害菌具有抑菌能力，其中对须癣毛癣菌效果最好，MIC为0.005 mg/mL，其他7种菌MIC在1.25～10 mg/mL之间。因此，无患子皂苷对有害菌具有较好的抑菌活性，且为植物来源成分，对皮肤刺激小，安全可靠，可作为天然抑菌剂使用。