截叶铁扫帚水部位促胃肠动力作用的研究

梁生林，颜峰光，李庆耀

井冈山大学医学部，吉安 343009

截叶铁扫帚Lespedezacuneata(Dum.-Cours.)G.Don为豆科胡枝子属植物，又名夜关门、铁马鞭、三叶公母草、鱼串草，以根和全株入药。分布于江西、福建、广东、广西、江苏、渐江、河南、湖北、四川、贵州和云南等省区。性平，味甘、微苦。具清热利湿，消食除积，祛痰止咳的功效，可用于消化不良，小儿疳积，胃肠炎，细菌性痢疾，胃痛，黄疸型肝炎，咳嗽，支气管炎等治疗[1]。截叶铁扫帚含黄酮类、酚酸类、木脂素类、甾体类、萜类等化合物[2,3]，具有保肝、抗菌、抗炎、抗氧化等多种生物活性[2]。但有关截叶铁扫帚胃肠促动作用的研究尚未见报道。在前期研究中，发现截叶铁扫帚水提和醇提物均具有明显胃肠促动作用，进一步用不同极性溶剂对截叶铁扫帚水提液进行萃取，并在离体家兔空肠管上进行预试，结果发现截叶铁扫帚水提液萃取后的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位中，只有水部位具有明显促进肠收缩作用。因此，本研究主要观察了截叶铁扫帚水部位对在体胃排空和肠推进运动、离体胃肠平滑肌收缩的促进作用；为追踪截叶铁扫帚促胃肠动力活性的物质基础，将截叶铁扫帚水部位上大孔树脂进一步分离并评价各组分的体内外促胃肠运动。通过检测活性组分用药后小鼠血清胃动素(MTL)、生长激素释放肽(ghrelin)和血管活性肠肽(VIP)含量变化；以及能否逆转阿托品、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素对离体空肠管收缩的抑制作用，以初步探究其胃肠促动作用的机制。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

昆明种小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号 SCXK(湘)2011-0003。小鼠喂养在恒定温度23±1 ℃、每12 h规律地明/暗交替的环境中，自由饮水和进食，实验前小鼠至少需要5天的适应环境时间。豚鼠，SPF级，体质量180～250 g，雌雄不拘；中国白兔，体质量2～3 kg，雌雄不拘，均由南昌大学实验动物部提供，实验动物许可证号 SCXK(赣)2014-0005。截叶铁扫帚采于江西吉安，经井冈山大学医学部药学教研室周秋贵副教授鉴定为豆科胡枝子属植物截叶铁扫帚Lespedezacuneata(Dum.-Cours.)G.Don的全草；莫沙必利片，成都康弘药业集团股份有限公司，规格5 mg/片，批号111102；硫酸阿托品注射液，天津金耀氨基酸有限公司，规格1 mL∶0.5 mg，批号1501071；重酒石酸去甲肾上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司，规格1 mL∶2 mg，批号1606071；盐酸异丙肾上腺素注射液，上海禾丰制药有限公司，规格2 mL∶1 mg，批号41150101；小鼠胃动素(MTL)ELISA测试盒、小鼠生长激素释放肽(ghrelin)ELISA测试盒，均购于上海士锋生物科技有限公司；小鼠血管活性肠肽(VIP)ELISA检测试剂盒，由上海樊克生物科技有限公司提供；D101大孔树脂，购于河北沧州宝恩材料有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；H1850R高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；A590紫外/可见分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司；BIO-RAD680酶标仪，美国Bio-Rad公司；RM6240微机生物信号采集处理系统，张力换能器，成都仪器厂；CP214电子天平，奥豪斯仪器(常州)有限公司。

2 实验方法

2.1 截叶铁扫帚水部位及其各洗脱组分的制备

称取干燥截叶铁扫帚500 g，第1次加12倍的蒸馏水用文火煎煮1 h，第2、3次各加10倍的蒸馏水分别煎煮0.5 h，合并3次煎出液，静置，过滤，取滤液，浓缩至500 mL。将500 mL截叶铁扫帚水提液装于1 000 mL分液漏斗中，分别以500 mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇为溶剂进行萃取，反复多次，直至萃取液无色为止，正丁醇萃取后的剩余部分回收溶剂后得水部位浸膏65.26 g。取32.63 g水部位浸膏，溶于500 mL蒸馏水中，取经预处理的D101大孔树脂500 g，装入层析柱中至柱高为85 cm，将溶于500 mL蒸馏水的水部位，以1 mL/min的流速通过大孔树脂柱吸附，依次用蒸馏水和20%、40%、60%、95%各浓度乙醇洗脱，洗脱体积为1 000 mL，将洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得水洗脱组分22.0 g、20%乙醇洗脱组分3.75 g、40%乙醇洗脱组分1.95 g、60%乙醇洗脱组分0.4 g、95%乙醇洗脱组分0.275 g。用时均用蒸馏水溶解配制成浓度为15或30 mg/mL的原液。

2.2 小鼠胃排空和小肠推进运动实验

参考文献[4,5]方法，168只雌雄各半小鼠，按体质量和性别随机均分为14组：模型组(蒸馏水10.00 mL/kg)，莫沙必利(0.003 g/kg)阳性对照组，截叶铁扫帚水部位、水洗脱组分和20%、40%、60%、95%乙醇洗脱组分高、低剂量组。截叶铁扫帚给药剂量参考《全国中草药汇编》成人每日用量25～50 g[1]，按动物与人体的每千克体质量等效剂量折算系数(12倍)换算成小鼠的剂量，截叶铁扫帚水部位及各洗脱组分的给药剂量按萃取量相当于生药量的比例进行换算。小鼠均ig给药，给药容量均为10 mL/kg，1次/天，连续给5天药。第4天灌药后禁食不禁水20 h，末次灌药后1 h，小鼠均灌胃给予半固体营养糊(羧甲基纤维素2.5 g放入62.5 mL蒸馏水中，加热搅拌溶解后，分别加入奶粉4 g，糖2 g，淀粉2 g，碳素墨水1 mL，每加一次搅拌均匀，配成75 mL约75 g的黑色糊状物)，每只0.5 mL，20 min后脱颈处死小鼠，剪开腹腔，用细线在胃贲门和幽门处分别结扎，迅速从胃贲门处至回肠末端分离胃肠，轻轻剥离肠系膜后，在不过度用力牵拉的情况下将胃肠铺直于白色实验台上，用尺子测量幽门到黑色半固体糊前沿的距离和幽门到回盲部的小肠全长，计算小肠推进率。再剪下胃，用滤纸把胃拭干后称全重，然后沿胃大弯纵行剪开胃，把胃内容物洗去，拭干后称净重，计算胃内残留率。

胃内残留率=(胃全重-胃净重)/灌服半

固体糊重量×100%

小肠推进率=幽门到黑色半固体糊前沿的

距离/幽门到回盲部小肠全长×100%

2.3 离体平滑肌收缩性实验

2.3.1 豚鼠离体胃底、胃窦环行肌及胃体纵行肌肌条制备

将禁食不禁水24 h豚鼠击头致死，打开胸腹，取出胃，置于预冷的Krebs液，沿胃大弯剪开胃腔，用预冷的Krebs液漂洗干净。找到胃底，用剪刀按环行肌纤维走向剪取宽长0.5 cm×1.5 cm的肌条，去除粘膜，两端用线结扎，一端连于浴管固定钩上，放入盛有15 mL Krebs液(Krebs液应在每次实验前新鲜配制)的麦氏浴管中，另一端连在张力换能器上，给予肌条1 g左右的前负荷。离体胃窦环行肌条：找到胃窦，用剪刀按环行肌纤维走向剪取宽长0.5 cm×1.5 cm的肌条；离体胃体纵行肌条：找到胃体，用剪刀按纵行肌纤维走向剪取宽长0.5 cm×1.5 cm的肌条；其他操作同胃底肌条。

2.3.2 家兔离体空肠管制备

将禁食不禁水24 h家兔击头致死，立即剖腹。取长约10 cm的空肠一段，迅速放入盛有冷Tyrode’s液的器皿中。将肠系膜及脂肪组织等剪去，将肠内容物冲洗干净。洗净肠腔后将肠管剪成1.5～2 cm长数段置于通有95%O2+5%CO2混合气体的Tyrode’s液中备用。取一小段肠管置于盛有Tyrode’s液的培养皿中，在其两端对角壁处用缝针穿线打结，一端固定在浴管固定钩上，放入装有20 mL Tyrode’s液的麦氏浴管中，另一端连接于张力换能器上，给予肠管2 g左右的前负荷。

2.3.3 离体平滑肌收缩性测定

参考文献[6]方法，恒温浴槽水温稳定在37±0.5 ℃，张力换能器与RM6240微机生物信号处理系统连接。通以95%O2+5%CO2混合气体，气体流量调至浴管中气泡一个个逸出(1～2个/s为宜)。胃底、胃窦和胃体肌条实验：待离体胃肌条收缩活动稳定30 min后开始实验。截叶铁扫帚水部位及其各洗脱组分从12.5 μL开始以2倍的累积浓度方式加入浴管，如原浓度为15 mg/mL组分加入到15 mL浴管，则终浓度分别为12.5、25、50、100、200 μg/mL，实验时先记录一段正常收缩曲线，每次给药后记录胃肌条活动曲线5 min。兔空肠管实验：待空肠管收缩活动稳定30 min后开始实验。截叶铁扫帚水部位及其各洗脱组分也是采用累积方式向浴管中加入药物，实验时先记录一段正常收缩曲线，每次给药后记录空肠管活动曲线5 min，并按照下式计算收缩活动力：收缩活动力=收缩幅度×收缩频率。在阿托品、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素对抗实验中，先分别加入上述三种药物，孵育3 min，再加入终浓度为9.375 mg/mL的截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分(通过前面兔离体空肠管实验可知，9.375 mg/mL对离体空肠管的收缩作用最强，因而用该浓度来进行对抗实验)。

2.4 小鼠血清MTL、ghrelin和VIP含量测定

取48只小鼠，雌雄各半，按性别和体质量随机均分为4组：模型组(蒸馏水10.00 mL/kg)，莫沙必利(0.003 g/kg)阳性对照组，截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分高、低剂量组。小鼠均ig给药，给药容量均为10 mL/kg，1次/天，连续给5天药。末次给药后1 h摘眼球取血，室温静置2 h，于4 ℃ 3 000 rpm离心10 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存备用。血清MTL、ghrelin 和VIP含量测定均按试剂盒说明书进行操作。

2.5 统计学处理

3 结果与分析

3.1 截叶铁扫帚水部位及其各洗脱组分对小鼠胃排空、小肠推进运动的影响

与模型组比较，莫沙必利(0.003 g/kg)组、截叶铁扫帚水部位及20%乙醇洗脱组分高、低剂量组均使胃内残留率显著降低(P<0.01)。与莫沙必利组比较，截叶铁扫帚水部位及20%乙醇洗脱组分高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。与模型组比较，莫沙必利(0.003 g/kg)组、截叶铁扫帚水部位及20%乙醇洗脱组分高、低剂量组均明显促进小肠运动，小肠推进率明显高于模型组(P<0.01，P<0.05)。与莫沙必利组比较，截叶铁扫帚水部位及20%乙醇洗脱组分高、低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 截叶铁扫帚水部位及各洗脱组分对小鼠胃排空、小肠推进运动的影响

3.2 截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分对小鼠血清MTL、ghrelin 和VIP含量的影响

截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分高、低剂量组，明显升高小鼠血清MTL、ghrelin含量，明显降低小鼠血清VIP含量，与模型组比较，差异显著(P< 0.01)；莫沙必利组也明显升高小鼠血清MTL、ghrelin含量和明显降低小鼠血清VIP含量，与模型组比较，差异显著(P<0.01)。结果见表2。

表2 截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分对小鼠血清MTL、ghrelin和VIP的影响

3.3 截叶铁扫帚水部位及其各洗脱组分对豚鼠胃底环行肌的作用

截叶铁扫帚水部位400 μg/mL和20%乙醇洗脱组分25 μg/mL时，胃底环行肌收缩波幅度最大，收缩频率和收缩张力也明显提高，与给药前比较差异显著(P<0.01)。水洗脱组分400 μg/mL胃底环行肌收缩波幅度、收缩频率和收缩张力与给药前比较无明显差异(P>0.05)。结果见表3。

表3 截叶铁扫帚水部位及各洗脱组分对豚鼠胃底环形肌的作用

3.4 截叶铁扫帚水部位及其各洗脱组分对豚鼠胃窦环行肌的作用

截叶铁扫帚水部位400 μg/mL和20%乙醇洗脱组分400 μg/mL时，胃窦环行肌收缩波幅度最大，收缩频率也明显提高，与给药前比较差异显著(P<0.01，P<0.05)。水洗脱组分400 μg/mL胃窦环行肌收缩波幅度、收缩频率和收缩张力与给药前比较无明显差异(P>0.05)。结果见表4。

表4 截叶铁扫帚水部位及各洗脱组分对豚鼠胃窦环行肌的作用

3.5 截叶铁扫帚水部位及其各洗脱组分对豚鼠胃体纵行肌的作用

截叶铁扫帚水部位400 μg/mL和20%乙醇洗脱组分100 μg/mL时，胃体纵行肌收缩波幅度最大，收缩频率增加，与给药前比较差异显著(P<0.01)。水洗脱组分400 μg/mL胃体纵行肌收缩波幅度、收缩频率和收缩张力与给药前比较无明显差异(P>0.05)。结果见表5。

表5 截叶铁扫帚水部位及各洗脱组分对豚鼠胃体纵行肌的作用

3.6 截叶铁扫帚水部位及其各洗脱组分对家兔离体空肠平滑肌的影响

截叶铁扫帚水部位150 μg/mL和20%乙醇洗脱组分9.375 μg/mL时，家兔离体空肠管收缩幅度最大，收缩频率加快，收缩活动力也明显增加，与给药前比较差异显著(P<0.01，P<0.05)。水洗脱组分300 μg/mL空肠管收缩幅度、收缩频率和收缩张力与给药前比较无明显差异(P>0.05)。结果见表6。

表6 截叶铁扫帚水部位及各洗脱组分对家兔离体空肠管的作用

3.7 阿托品对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分所致的家兔离体空肠管收缩的影响

在20 mL Tyrode’s液中滴加终浓度为9.375 mg/mL的截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分，空肠管收缩幅度、收缩频率明显增加，与给药前比较，差异显著(P<0.01，P<0.05)；收缩张力稍有提高，但与给药前比较差异无统计学意义(P>0.05)。在20 mL Tyrode’s液中滴加阿托品至浓度为1×10-6mol/L，可见空肠管收缩幅度明显降低，与给药前比较，差异显著(P<0.01)；3 min后在阿托品基础上再滴加终浓度为9.375 mg/mL的截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分，空肠管收缩幅度明显增加，与阿托品比较，差异显著(P<0.01)，与单用20%乙醇洗脱组分比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表7。

表7 阿托品对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分所致的家兔离体空肠管收缩的作用

3.8 去甲肾上腺素对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分所致的家兔离体空肠管收缩的影响

在20 mL Tyrode’s液中滴加终浓度为9.375 mg/mL的截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分，空肠管收缩幅度明显增加，与给药前比较，差异显著(P<0.01)；收缩频率、收缩张力稍有提高，但与给药前比较差异无统计学意义(P>0.05)。在20 mL Tyrode’s液中滴加去甲肾上腺素至浓度为1×10-6mol/L，可见空肠管收缩幅度明显降低，收缩张力明显下降，与给药前比较，差异显著(P<0.01)；3 min后在去甲肾上腺素基础上再滴加终浓度为9.375 mg/mL的截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分，空肠管收缩幅度明显增加，收缩张力明显提高，与去甲肾上腺素比较，差异显著(P<0.01)，达到了给去甲肾上腺素前水平，但收缩幅度远低于单用截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分水平(P<0.01)。结果见表8。

表8 去甲肾上腺素对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分所致的家兔离体空肠管收缩的作用

3.9 异丙肾上腺素对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分所致的家兔离体空肠管收缩的影响

在20 mL Tyrode’s液中滴加终浓度为9.375 mg/mL的截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分，空肠管收缩幅度明显增加，与给药前比较，差异显著(P<0.01)；收缩频率、收缩张力稍有提高，但与给药前比较差异无统计学意义(P>0.05)。在20 mL Tyrode’s液中滴加异丙肾上腺素至浓度为1×10-6mol/L，可见空肠管收缩幅度明显降低，收缩张力明显下降，与给药前比较，差异显著(P<0.01)；3 min后在此基础上再滴加终浓度为9.375 mg/mL的截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分，空肠管收缩幅度和收缩张力无明显变化，与异丙肾上腺素比较无统计学意义(P>0.05)。结果见表9。

表9 异丙肾上腺素对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分所致的家兔离体空肠管收缩的作用

4 讨论与结论

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)是临床常见的胃肠疾病之一，其患病率较高，西方国家为10%～40%，亚洲国家为5%～30%[7]；我国FD的发病率为18%～45%，占消化科门诊的20%～50%[8]；且FD病情反复发作迁延不愈，严重影响了人们的身体健康和生存质量。功能性消化不良，其主要病理变化是胃肠动力障碍[9]，胃肠动力障碍主要表现为胃排空延迟、肠传输减慢[10,11]，因而促进胃排空、肠蠕动在功能性消化不良的治疗中发挥重要作用。但是目前临床上促胃肠动力药存在疗效不佳或副反应严重的问题[12]，因此研发新的促胃肠动力药具有重要意义。

本实验发现截叶铁扫帚水部位及其20%乙醇洗脱组分ig给药能使小鼠胃内残留率显著减少，小肠推进率明显增加，表明截叶铁扫帚水部位具有显著促进在体小鼠胃排空、肠推进运动的作用，且促进胃排空、肠推进运动的活性组分是20%乙醇洗脱组分。

胃底环行肌节律性收缩和胃体纵行肌向前推进运动，以及胃窦环行肌节律性收缩，能促进胃排空；小肠管壁环行肌节律性收缩促进小肠分节运动，纵行肌的向前推进运动促进小肠蠕动[4]。本实验截叶铁扫帚水部位及其20%乙醇洗脱组分能使离体豚鼠胃底、胃窦环行肌和胃体纵行肌收缩波幅度增加，收缩频率加快，这表明截叶铁扫帚水部位能使胃底、胃窦环行肌和胃体纵行肌收缩运动加强，以促进胃排空。同时也能促进离体家兔空肠管收缩幅度增加、收缩活动力增强。

MTL是启动胃肠收缩活动的脑肠肽，是评价胃肠动力的敏感指标[13]。在消化间期呈周期性释放，通过作用于肠胃神经系统的MTL神经元，引发胃肠道消化间期移行性复合运动(migrating motor complex，MMC)Ⅲ相的发生，引起胃强烈的收缩，促进胃排空，加快小肠明显分节运动，使内容物向小肠远端传递[14-16]。故血浆MTL水平升高，胃肠运动加速，肠内容物通过加快[17]。Ghrelin主要由胃底黏膜泌酸腺细胞分泌，分布于胃肠道和中枢神经系统，与其受体结合后通过中枢和外周途径加速胃肠运动，也是目前公认的具有促进胃肠运动的脑肠肽[18,19]。VIP广泛分布于肠道和神经系统，是一类对胃肠运动有抑制作用的神经肽，可以延缓胃排空、减慢小肠运动[20]。本实验证明，截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分能升高小鼠血清MTL、ghrelin含量，降低小鼠血清VIP含量，这表明截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分促进胃排空、肠推进运动的作用机制可能与促进MTL、ghrelin的产生和减少VIP的生成有关。

胃肠平滑肌具有M胆碱受体和α、β2肾上腺素受体，通过兴奋M受体或抑制α、β2受体通路，可引起胃肠平滑肌收缩，张力增强，收缩幅度加大。本实验显示，阿托品对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分收缩空肠管作用无影响，去甲肾上腺素对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分收缩空肠管作用有一定的拮抗作用，异丙肾上腺素对截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分收缩空肠管作用具有明显拮抗作用，这表明截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分胃肠促动作用可能与胃肠M受体无关，与抑制胃肠β受体通路有关，部分与α受体通路抑制具有一定的关系。

综上所述，截叶铁扫帚水部位能明显促进胃肠运动，其促进胃肠运动的活性组分是20%乙醇洗脱组分。截叶铁扫帚含有黄酮类、酚酸类、木脂素类、甾体类、萜类等，尤其是酚酸类化合物，极性较多，可被D101大孔树脂吸附，本实验20%乙醇洗脱组分的促胃肠运动成分很可能是上述类型中含有酚羟基、羧基等极性基团的化学成分。下一步的研究将进一步明确截叶铁扫帚水部位20%乙醇洗脱组分的主要成分，对其更深入的研究，以为开发出治疗功能性消化不良或胃肠动力障碍性疾病的新药提供理论基础。