基因Ⅰ型乙型脑炎病毒亚单位疫苗候选抗原的免疫原性比较

于瑞明，田占成，高闪电，独军政，刘光远，罗建勋，殷宏,2

·动物及兽医生物技术·

基因Ⅰ型乙型脑炎病毒亚单位疫苗候选抗原的免疫原性比较

于瑞明1，田占成1，高闪电1，独军政1，刘光远1，罗建勋1，殷宏1,2

1 中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046 2 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009

为了筛选出免疫原性最佳的基因Ⅰ型乙型脑炎病毒亚单位疫苗候选抗原，将基因Ⅰ型JEV GS株的prMEIII融合基因、polytope复合表位基因和prMEIII-polytope融合基因分别克隆构建到原核表达载体pET-30a上，经诱导表达纯化获得重组蛋白。将制备的重组蛋白免疫小鼠，通过ELISA监测体液免疫反应、通过噬斑减少中和试验滴定中和抗体滴度、通过细胞因子表达丰度和淋巴细胞增殖实验分析细胞介导的免疫反应，比较分析制备的乙型脑炎病毒亚单位疫苗候选抗原的免疫原性。结果表明：获得的分子量分别为35 kDa (prMEIII)、28 kDa (polytope复合表位抗原) 和57 kDa (prMEIII-polytope) 的重组蛋白均能诱导免疫小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫反应。与prMEIII-polytope和polytope重组蛋白免疫组相比，prMEIII蛋白可诱导免疫小鼠产生更高的IL-2和IFN- γ表达丰度和淋巴细胞增殖水平 (<0.05)。prMEIII蛋白免疫小鼠诱导产生的中和抗体滴度接近于商品化乙脑减毒疫苗SA14-14-2 (>0.05)。上述研究结果表明，prMEIII重组蛋白可以作为乙型脑炎病毒亚单位疫苗的备选蛋白。

流行性乙型脑炎，复合表位，亚单位疫苗，免疫原性

猪流行性乙型脑炎 (Japanese encephalitis，JE)是猪感染乙型脑炎病毒 (Japanese encephalitis virus，JEV) 引起的一种自然疫源性疾病，许多动物感染后都可成为本病的传染源[1]。三带喙库蚊是该病毒的主要传播媒介，叮咬猪后可传染给猪，病毒在猪体内可大量繁殖。因此，猪是该病毒的主要扩增宿主[2]。猪感染JEV后，主要患生殖系统疾病，可造成怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎，公猪睾丸炎，使公猪的精子数量减少、活力降低。幸存的仔猪常出现震颤、惊厥等神经症状。成年猪感染JEV后死亡率接近于零，但仔猪感染JEV后，死亡率可达100%[3]。据报道，随着近年来JEV新基因型的出现[4]，基因Ⅰ型JEV毒株有替代基因Ⅲ型JEV毒株成为主要流行毒株的趋势，且现有的基因Ⅲ型JEV减毒疫苗SA-14-14-2对部分基因Ⅰ型JEV流行毒株的保护力较差[5-9]。因此，基因Ⅰ型JEV疫苗研制的问题迫在眉睫。

JEV是单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球形，有囊膜[10]。prM/M和E蛋白是JEV的主要结构蛋白，E蛋白是诱发机体产生中和抗体的主要免疫抗原[11]。prM蛋白是M蛋白的前体蛋白，以分子伴侣的形式辅助E蛋白正确折叠、组装和运输，是E蛋白诱发机体产生保护性免疫的重要协同成分[12]。JEV NS1蛋白诱导机体产生的特异性抗体具有补体结合活性，通过介导细胞融合而获得中和病毒的能力，从而抵抗JEV的感染和入侵[13]。此外，Kumar等用原核表达的NS3蛋白免疫小鼠，诱发机体产生Th1型细胞免疫反应[14]。

尽管现有JEV减毒疫苗可用于猪场JE的防治，但安全性问题仍不可忽视[15]。基因工程亚单位疫苗因其只含有病原体抗原，不含核酸，具有安全性好、产量和纯度高及稳定性好等优点，尽管存在后续工艺优化等诸多问题，但依然成为研制新型JEV疫苗的热点之一[16]。本研究选取基因Ⅰ型JEV GS株的prMEIII融合蛋白，以及结合文献报道及软件预测筛选的E蛋白 (EIII结构域除外)、NS1和NS3蛋白抗原表位组成的polytope (复合表位)抗原和prMEIII-polytope融合蛋白免疫小鼠，比较这些JEV亚单位疫苗候选抗原的免疫原性，分析复合表位抗原polytope免疫原性的同时，观察复合表位抗原polytope与prMEIII重组蛋白融合表达之后能否促进prMEIII重组蛋白的免疫原性，以期筛选出基因Ⅰ型JEV亚单位疫苗的最佳候选抗原。

1 材料与方法

1.1 材料

甘肃省平凉市周边地区收集的蚊虫媒介分离的基因Ⅰ型JEV GS株[17]；幼年仓鼠肾 (Baby harmster kidney，BHK) 细胞、原核表达载体pET-30a均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存；大肠杆菌Rosetta (DE3) 菌株购于天根生化科技(北京) 有限公司；猪乙型脑炎病毒减毒活疫苗(SA14-14-2) 购于中牧实业股份有限公司。雌性BALB/C小鼠 (4–6周龄) 由兰州兽医研究所实验动物中心提供。碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG购自美国Sigma公司；辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠细胞因子检测试剂盒购于深圳达科为生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物设计

参照GenBank中JEV DH10M978 参考序列 (KT229573)，利用Primer Premier 5.0生物学软件设计克隆、表达和重叠延伸PCR所需引物 (表1)，委托生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

1.2.2 复合多表位基因的设计与合成

根据文献[14,18]报道及网络服务器CTL Pred、Bce Pred和表位预测软件Epitopia、Ellipro对基因Ⅰ型JEV GS株的E、NS1及NS3蛋白表位进行预测和筛选，综合评价各分析软件获得的结果和文献中所报道的实验数据，选定13个表位氨基酸序列作为复合表位。为保证各表位之间功能的独立性，T细胞表位之间用AAA作为Linker，B细胞表位之间采用GPGPG作为Linker，将各个表位串联起来，合成得到polytope基因，序列如下所示：

表1 克隆、表达和融合PCR所需引物

Underline displayed restriction site.

1.2.3 基因的扩增

TRIzol法从JEV感染的BHK21细胞中提取RNA，经PrimeScriptTMRT-PCR Kit反转录获得一链cDNA模板，扩增获得prM、EIII基因，通过重叠 PCR方法获得prMEIII融合基因，进一步用表1中的引物与合成的polytope基因采用重叠延伸PCR的方法获得prMEIII-polytope融合基因。经琼脂糖凝胶电泳检测正确后，胶回收目的片段。

1.2.4 重组质粒的构建和重组蛋白的诱导表达纯化

将获得的目的基因片段prMEIII、polytope、prMEIII-polytope及pET-30a载体分别进行双酶切处理，酶切产物进行胶回收纯化后，用T4 DNA连接酶在16 ℃连接过夜。将连接产物转化.JM109感受态细胞，将PCR鉴定为阳性的菌液委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，将测序正确的阳性重组质粒命名为pET-30a-prMEIII、pET-30a-polytope和pET-30a-prMEIII-polytope。将阳性重组质粒分别转化.Rosetta(DE3) 感受态细胞，转化菌加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达，在0 h和6 h取样用于SDS-PAGE检测。诱导后的菌体沉淀经超声后4 ℃、10 000 r/min离心15 min，取上清和沉淀用于SDS-PAGE检测。按照Ni-NTA Superflow Cartridge手册进行镍柱亲和层析纯化重组蛋白，用Solarbio公司的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化的重组蛋白浓度。纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE检测。

1.2.5 免疫印迹分析

为了检测prMEIII融合蛋白鼠源多克隆抗体与JEV天然蛋白的反应原性，收集基因Ⅰ型JEV GS株感染BHK21细胞48 h后的细胞样品，SDS-PAGE后，转印PVDF膜进行免疫印迹分析，以prMEIII融合蛋白免疫小鼠制备的血清为一抗(1∶500稀释)，碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG为二抗 (1∶6 000稀释)，用NBT/BCIP显色，PBS免疫小鼠的血清作为阴性对照。同时将纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE，用Trans-Blot®Turbo™转印系统转印PVDF膜进行免疫印迹分析，以小鼠抗多聚组氨酸单克隆抗体为一抗 (1∶1 000稀释)，碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG为二抗 (1∶6 000稀释)，用NBT/BCIP显色。

1.2.6 动物免疫实验方案

将40只4–6周龄雌性BALB/C小鼠按照8只/组，分为5组，开展动物免疫试验。各组小鼠在第0、14和28天分别免疫一次，蛋白免疫组 (prMEIII、polytope和prMEIII-polytope) 一免和二免采用背部皮下多点注射含有免疫佐剂的50 μg抗原进行免疫。一免用弗氏完全佐剂，二免用弗氏不完全佐剂，三免采用腹腔注射100 μg不含佐剂的抗原加强免疫。SA14-14-2弱毒疫苗免疫组和PBS免疫组免疫剂量为200 μL。第0、7、14、21、28、35、42天，通过小鼠尾尖采血制备血清，−20 ℃冻存备用，第42天各免疫组随机取3只小鼠眼球采血制备血清用于细胞因子表达丰度和中和抗体滴度滴定，断颈处死后，采集脾脏制备淋巴细胞用于淋巴细胞增殖实验。

1.2.7 特异性抗体水平监测

应用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清中特异性抗体水平，将镍柱亲和层析纯化的EIII蛋白[17]0.5 μg/孔包被板子，5%脱脂奶粉封闭，每孔加入从1︰100开始2倍倍比稀释的免疫小鼠血清作为一抗，HRP标记山羊抗小鼠IgG (1∶2 500) 作为二抗，酶标仪测定450 nm波长吸光光度值，以P/N>2.1的血清最大稀释倍数为被检血清特异性抗体效价。

1.2.8 中和抗体滴度测定

噬斑减少中和试验测定初免后第42 天采集的各免疫组小鼠血清中和抗体滴度，将各免疫组小鼠血清56 ℃灭活30 min，从1∶10开始进行 2倍倍比稀释，将稀释的血清与含有100 PFU的病毒液等体积混合，设PBS免疫小鼠血清处理病毒组作为对照组，以能减少对照组50%空斑数的血清最高稀释度为该血清的中和抗体效价。

1.2.9 细胞因子表达丰度检测

应用达优®小鼠细胞因子ELISA试剂盒检测初免后第42 天采集的各免疫组小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的表达水平。

1.2.10 淋巴细胞增殖实验

将制备的2×106/mL的淋巴细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，100 μL/孔，加入终浓度为 5 μg/mL的免疫抗原刺激淋巴细胞，每个样品重复3孔，并设ConA (终浓度为5 μg/mL) 刺激细胞阳性对照和空白细胞阴性对照，将96孔板放置于细胞培养箱中培养72 h。每孔加入10 μL WST-1溶液，继续培养3–4 h，酶标仪测定450值，计算刺激指数 (SI)=450，试验–450，对照/450，对照–450，空白。

1.2.11 统计学分析

使用GraphPad Prism Version 5软件进行实验数据的统计学分析。利用单因素方差分析或检验分析各免疫组间实验数据的差异 (<0.05表示差异显著，<0.01表示差异极显著)。

2 结果与分析

2.1 基因的扩增

以JEV cDNA和pUC57-polytope为模板，扩增得到基因prM (501 bp)、EIII (282 bp)和polytope (627 bp)基因，通过重叠延伸PCR的方法获得prMEIII融合基因(786 bp)和prMEIII-polytope融合基因 (1 416 bp) (图1)，获得的目的片段与预期大小一致。

2.2 重组蛋白的诱导表达和纯化

SDS-PAGE结果显示，重组prMEIII和prMEIII-polytope蛋白主要以包涵体形式表达，分子量大小分别约为35 kDa和57 kDa，重组polytope蛋白主要以可溶性形式表达，分子量大小约为28 kDa，进一步经镍柱亲和层析纯化，获得了纯度较高的重组蛋白 (图2)。纯化的prMEIII、polytope和prMEIII-polytope重组蛋白的浓度分别是600 μg/mL、800 μg/mL和530 μg/mL。

图1 PCR扩增靶基因

图2 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析

2.3 prMEIII融合蛋白鼠源多克隆抗体与JEV天然抗原的特异性反应

免疫印迹分析结果表明，prMEIII蛋白免疫小鼠制备的血清能够特异性识别JEV的53 kDa的E蛋白和19 kDa的prM蛋白 (图3A)。抗组氨酸蛋白抗体特异性识别了纯化的重组蛋白，分子量大小分别为35 kDa (prMEIII)、28 kDa (polytope) 和57 kDa (prMEIII-polytope)，与预期重组蛋白分子量大小一致 (图3B)。

2.4 特异性抗体水平动态监测

通过间接ELISA测定第0、7、14、21、28、35、42天收集的免疫小鼠血清中的特异性抗体。结果显示，3种基因重组表达的蛋白质免疫组和减毒疫苗免疫组均可诱导小鼠产生特异性抗体, 但减毒疫苗SA-14-14-2免疫组诱导产生的抗体水平显著低于本研究所重组表达的蛋白免疫组 (图4)。

图3 重组蛋白及prMEIII重组蛋白制备抗体的特异性免疫反应性分析

图4 特异ELISA抗体滴度动态曲线

2.5 中和抗体滴度的测定

噬斑减少中和试验测定免疫小鼠血清的中和抗体滴度，结果显示，prMEIII蛋白免疫组平均中和抗体滴度为1∶200，polytope蛋白免疫组平均中和抗体滴度为1∶50，prMEIII-polytope蛋白免疫组平均中和抗体滴度为1∶80，SA14-14-2减毒疫苗组平均中和抗体滴度为1∶240。prMEIII蛋白免疫组平均中和抗体滴度显著高于其他蛋白免疫组 (polytope和prMEIII-polytope) (<0.05)，接近于SA14-14-2减毒疫苗免疫组 (>0.05) (图5)。

图5 中和抗体滴度检测

2.6 细胞因子表达丰度检测

利用细胞因子ELISA检测试剂盒检测首免后第42 天小鼠血清中的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4的表达水平。结果显示，prMEIII蛋白免疫组的细胞因子 (IL-2、IFN-γ和IL-4) 表达水平显著高于其他蛋白免疫组 (<0.05)，其中IL-4的表达水平最高，与其他蛋白免疫组和商品化减毒疫苗SA14-14-2免疫组相比差异极显著 (<0.01)，而prMEIII蛋白免疫组的IL-2和IFN-γ的表达水平与商品化减毒疫苗SA14-14-2免疫组相比差异不显著 (>0.05) (图6)。

图6 免疫小鼠血清中的细胞因子表达丰度

2.7 淋巴细胞增殖水平检测

利用WST法测定免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力，以评价重组蛋白免疫小鼠诱导产生的细胞免疫水平。结果显示，prMEIII-polytope蛋白免疫组的SI值为1.75±0.95，prMEIII 蛋白免疫组SI值为2.465±0.065，polytope免疫组SI值为1.68±0.06，SA14-14-2减毒疫苗组用prMEIII融合蛋白刺激的SI值为1.76±0.085，而用ConA刺激的SI值为2.365±0.075。prMEIII蛋白免疫组的刺激指数显著高于其他免疫组 (<0.05)，但与ConA刺激的SA14-14-2减毒疫苗组SI值接近(图7)。

3 讨论

疫苗接种是预防人类和猪流行性乙型脑炎的最有效方法，减毒或嵌合减毒JEV活疫苗对于怀孕母猪的安全性存在争议[15]，福尔马林灭活改变了E蛋白的抗原结构，影响了灭活JEV疫苗的免疫效力[19]。尽管现有疫苗存在一定问题，但目前仍是预防JEV感染的首选[20]。因此，研制安全高效且成本低廉的新型JEV疫苗势在必行。病毒样颗粒因其空间结构类似于天然病毒粒子，其免疫保护效果接近于减毒疫苗，但由于生产成本的问题和达不到规模化生产的要求，病毒样颗粒疫苗的研发任重而道远。因此，其他类型蛋白亚单位疫苗成为研发新型JEV疫苗的热点之一[16]。疫苗免疫保护效应与所选择的抗原密切相关，因此，筛选出最有效的疫苗候选抗原对于疫苗免疫保护效应至关重要[21-23]。为了筛选出免疫效应能接近JEV减毒疫苗的最佳抗原单位，本研究选取基因Ⅰ型JEV GS株的prMEIII融合蛋白、E蛋白 (除EIII结构域) 、NS1和NS3蛋白的抗原表位串联形成的复合表位polytope抗原和prMEIII-polytope融合蛋白，通过免疫小鼠比较这些候选抗原的免疫原性。本研究获得了3个与预期分子量大小一致的纯度较高的融合蛋白 (prMEIII、polytope和prMEIII-polytope)，prMEIII融合蛋白免疫小鼠制备的血清可特异性识别JEV的天然E蛋白和prM蛋白，动物免疫实验结果表明，prMEIII融合蛋白的免疫原性显著优于其他候选抗原，可为JEV亚单位疫苗和诊断试剂的研发提供优质抗原。

图7 免疫小鼠淋巴细胞增殖检测

通过ELISA方法评估免疫小鼠诱导的体液免疫反应水平，重组蛋白免疫组诱导产生的平均特异性抗体水平显著高于商品化减毒疫苗SA14-14-2免疫组，这可能是由于ELISA包被抗原采用的是基因Ⅰ型JEV来源的EIII蛋白，而SA14-14-2减毒疫苗属于基因Ⅲ型JEV，JEV不同基因型之间E蛋白抗原性的差异导致测得的SA14-14-2减毒疫苗免疫组的平均抗体效价很低[24]。尽管这样，SA14-14-2减毒疫苗免疫组的细胞因子IL-4、IL-2和IFN-γ的表达水平接近于prMEIII蛋白免疫组，显著高于polytope和prMEIII- polytope蛋白免疫组。SA14-14-2减毒疫苗免疫小鼠可诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，该细胞介导的免疫反应对于抵抗乙型脑炎病毒的感染和入侵至关重要，特别是Th1型细胞免疫反应[25]。prMEIII蛋白免疫组的细胞因子 (IFN-γ、IL-2和IL-4) 表达水平均显著高于polytope和prMEIII-polytope蛋白免疫组，说明prMEIII蛋白免疫小鼠诱导产生强烈的Th1和Th2型细胞免疫反应，这同淋巴细胞增殖实验结果一致，prMEIII蛋白免疫组的淋巴细胞增殖水平显著高于polytope和prMEIII-polytope蛋白免疫组。此外，prMEIII蛋白免疫组诱导产生的平均中和抗体水平接近于SA14-14-2减毒疫苗免疫组。据此推断，SA14-14-2减毒疫苗与本研究中的基因Ⅰ型JEV GS株可能具有较好的交叉免疫保护性。此外，复合表位抗原polytope集合了JEV E、NS1和NS3多个基因的主要抗原表位，但在本研究中所表现的免疫效力指标并不理想，尽管在polytope中存在NS1的多个抗原表位，但诱导产生的抗体能否具有抵抗JEV的感染和入侵的补体结合活性[26]还需要进一步实验验证。同时将polytope和prMEIII蛋白融合表达之后，反而降低了prMEIII重组蛋白的免疫效力。推断其可能是polytope与prMEIII蛋白融合表达后，影响了prMEIII蛋白有效表位的空间构象展示。因此，prMEIII蛋白被认为是本研究中研制新型JEV疫苗的最佳疫苗候选抗原。

综上所述，本研究制备的JEV亚单位疫苗候选抗原免疫小鼠均可诱导产生较强的体液免疫和细胞免疫反应，其中prMEIII融合蛋白免疫诱导产生的中和抗体水平接近于商品化减毒疫苗SA14-14-2，该研究为今后JEV亚单位疫苗的研制提供了新的思路。

[1] Campbell GL, Hills SL, Fischer M, et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ, 2011, 89(10): 766–774.

[2] Dhanda V, Mourya DT, Mishra AC, et al. Japanese encephalitis virus infection in mosquitoes reared from field-collected immatures and in wild-caught males. Am J Trop Med Hyg, 1989, 41(6): 732–736.

[3] Mengeling WL, Paul PS, Lager KM. Virus-induced maternal reproductive failure of swine. J Am Vet Med Assoc, 1993, 203(9): 1268–1272.

[4] Uchil PD, Satchidanandam V. Phylogenetic analysis of Japanese encephalitis virus: envelope gene based analysis reveals a fifth genotype, geographic clustering, and multiple introductions of the virus into the Indian subcontinent. Am J Trop Med Hyg, 2001, 65(3): 242–251.

[5] Schuh AJ, Ward MJ, Brown AJL, et al. Dynamics of the emergence and establishment of a newly dominant genotype of Japanese encephalitis virus throughout Asia. J Virol, 2014, 88(8): 4522–4532.

[6] Pan XL, Liu H, Wang HY, et al. Emergence of genotype I of Japanese encephalitis virus as the dominant genotype in Asia. J Virol, 2011, 85(19): 9847–9853.

[7] Wei JC, Wang X, Zhang JJ, et al. Partial cross-protection between Japanese encephalitis virus genotype I and III in mice. PLoS Negl Trop Dis, 2019, 13(8): e0007601.

[8] Fan YC, Chen JM, Chen YY, et al. Reduced neutralizing antibody titer against genotype I virus in swine immunized with a live-attenuated genotype III Japanese encephalitis virus vaccine. Vet Microbiol, 2013, 163(3/4): 248–256.

[9] Fan YC, Chen JM, Chiu HC, et al. Partially neutralizing potency against emerging genotype I virus among children received formalin-inactivated Japanese encephalitis virus vaccine. PLoS Negl Trop Dis, 2012, 6(9): e1834.

[10] Misra UK, Kalita J. Overview: Japanese encephalitis. Prog Neurobiol, 2010, 91(2): 108–120.

[11] Ding D, Kilgore PE, Clemens JD, et al. Cost-effectiveness of routine immunization to control Japanese encephalitis in Shanghai, China. Bull World Health Organ, 2003, 81(5): 334–342.

[12] Peng JG, Wu SC. Glutamic acid at residue 125 of the prM helix domain interacts with positively charged amino acids in E protein domain II for Japanese encephalitis virus-like-particle production. J Virol, 2014, 88(15): 8386–8396.

[13] Li YZ, Counor D, Lu P, et al. Protective immunity to Japanese encephalitis virus associated with anti-NS1 antibodies in a mouse model. Virol J, 2012, 9: 135.

[14] Kumar P. Conserved amino acids 193–324 of non-structural protein 3 are a dominant source of peptide determinants for CD4+and CD8+T cells in a healthy Japanese encephalitis virus-endemic cohort. J Gen Virol, 2004, 85(5): 1131–1143.

[15] Hsu ST, Chang LC, Lin SY, et al. The effect of vaccination with a live attenuated strain of Japanese encephalitis virus on stillbirths in swine in Taiwan. Bull World Health Organ, 1972, 46(4): 465–471.

[16] Donaldson B, Lateef Z, Walker GF, et al. Virus-like particle vaccines: immunology and formulation for clinical translation. Expert Rev Vaccines, 2018, 17(9): 833–849.

[17] Yu RM, Tian ZC, Du JZ, et al. Identification of EDIII protein from the genotype Ⅰ Japanese encephalitis virus. Chin Vet Sci, 2017, 47(12): 1475–1480 (in Chinese).于瑞明, 田占成, 独军政, 等. 基因Ⅰ型乙脑病毒ED Ⅲ结构域蛋白的原核表达及其抗体制备与鉴定. 中国兽医科学, 2017, 47(12): 1475–1480.

[18] Sanchez-Trincado JL, Gomez-Perosanz M, Reche PA. Fundamentals and methods for T- and B-Cell epitope prediction. J Immunol Res, 2017, 2017: 2680160.

[19] Fan YC, Chiu HC, Chen LK, et al. Formalin inactivation of Japanese encephalitis virus vaccine alters the antigenicity and immunogenicity of a neutralization epitope in envelope protein domain III. PLoS Negl Trop Dis, 2015, 9(10): e0004167.

[20] Mansfield KL, Hernández-Triana LM, Banyard AC, et al. Japanese encephalitis virus infection, diagnosis and control in domestic animals. Vet Microbiol, 2017, 201: 85–92.

[21] Lin HH, Yip BS, Huang LM, et al. Zika virus structural biology and progress in vaccine development. Biotechnol Adv, 2018, 36(1): 47–53.

[22] Van Loben Sels JM, Green KY. The antigenic topology of norovirus as defined by B and T cell epitope mapping: implications for universal vaccines and therapeutics. Viruses, 2019, 11(5): 432.

[23] Luca VC, AbiMansour J, Nelson CA, et al. Crystal structure of the Japanese encephalitis virus envelope protein. J Virol, 2012, 86(4): 2337–2346.

[24] Kurane I, Takasaki T. Immunogenicity and protective efficacy of the current inactivated Japanese encephalitis vaccine against different Japanese encephalitis virus strains. Vaccine, 2000, 18(S2): 33–35.

[25] Konishi E, Ajiro N, Nukuzuma C, et al. Comparison of protective efficacies of plasmid DNAs encoding Japanese encephalitis virus proteins that induce neutralizing antibody or cytotoxic T lymphocytes in mice. Vaccine, 2003, 21(25/26): 3675–3683.

[26] Lin YL, Chen LK, Liao CL, et al. DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice. J Virol, 1998, 72(1): 191–200.

Comparson of the immunogenicity of genotypeⅠJapanese encephalitis virus subunit vaccine candidate antigens

Ruiming Yu1, Zhancheng Tian1, Shandian Gao1, Junzheng Du1, Guangyuan Liu1, Jianxun Luo1, and Hong Yin1,2

1 State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu, China 2 Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

To screen the best genotypeⅠJapanese encephalitis virus subunit vaccine candidate antigens, the prMEIII gene, the polytope gene and the prMEIII-polytope fusion gene of the GenotypeⅠJapanese encephalitis virus GS strain were cloned into prokaryotic expression vector pET-30a. The recombinant proteins were obtained after the induction and purification. The prepared recombinant proteins were immunized to mice, and the immunogenicity of the subunit vaccine candidate antigens was evaluated through monitoring the humoral immune response by ELISA, detecting the neutralizing antibody titer by plaque reduction neutralization test, and testing the cell-mediated immune response by lymphocyte proliferation assay and cytokine profiling. The recombinant proteins with the molecular weights of 35 (prMEIII), 28 (polytope antigen) and 57 kDa (prMEIII-polytope) induced strong humoral and cellular immune responses in mice. Compared with prMEIII-polytope and polytope proteins, the prMEIII protein induced a significant expression of IL-2 and IFN-γ (<0.05) and the significant lymphoproliferation of splenocytes (<0.05). The neutralizing antibody titer induced by the prMEIII protein was close to that induced by the commercial attenuated vaccine SA14-14-2 (>0.05). The study suggests that the prMEIII protein can be used for the development of the Japanese encephalitis virus subunit vaccine.

Japanese encephalitis, polytope, subunit vaccine, immunogenicity

10.13345/j.cjb.190522

November 22, 2019;

March 23, 2020

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31201899), Agricultural Science and Technology Innovation Engineering Project (No. CAAS-ASTIP-2016-LVRI).

Zhancheng Tian. Tel: +86+931-8342681; E-mail: tianzhancheng@caas.cn

国家自然科学基金 (No. 31201899)，中国农业科学院农业科技创新工程(No. CAAS-ASTIP-2016-LVRI) 资助。

2020-05-06

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20200430.1642.001.html

于瑞明, 田占成, 高闪电, 等. 基因Ⅰ型乙型脑炎病毒亚单位疫苗候选抗原的免疫原性比较. 生物工程学报, 2020, 36(7): 1314–1322.

Yu RM, Tian ZC, Gao SD, et al. Comparson of the immunogenicity of genotypeⅠJapanese encephalitis virus subunit vaccine candidate antigens. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1314–1322.

(本文责编 郝丽芳)