授粉方式及时间对铁皮石斛蒴果发育的影响

周慧君, 魏翠华, 谢 宇, 陈芳兰, 陈 沁, 曾 凡

(福州市农业科学研究所，福建 福州 350018)

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)珍稀植物[1-4]，素有“九大仙草”之首的美称[5]。其主要成分为多糖，具有抗氧化、增强免疫力等功效[6-7]，还含有菲类化合物、生物碱、氨基酸等成分[8]，广泛应用于日常保健和疾病治疗。由于特殊的花器官构造，野生铁皮石斛结实率较低，且因其种子为无胚乳结构，使得发芽率低于3%[9]，加之人为滥采挖，造成野生资源濒临枯竭。当前市售铁皮石斛多为人工种植，可利用人工授粉提高铁皮石斛的授粉率[10]，再通过无菌播种缩短其生长周期。目前，有关铁皮石斛的研究多集中于品质影响因素分析[11-14]、化学成分的分析和提取[15-18]、亲缘关系的研究及杂交后代的分子鉴定[19-22]等方面。有关福建省铁皮石斛种质资源分析[23]及自花、异花授粉的杂交育种快繁技术[24]已见报道，但少有铁皮石斛多种质间的授粉方式及蒴果发育的相关研究。为了对福建省铁皮石斛资源进行品种创新，缓解野生资源压力，本研究对福建省适种的5个铁皮石斛种质进行不同授粉方式和授粉时间的试验，并研究了蒴果的发育情况，以期为铁皮石斛的繁育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料来源于福州市农业科学研究所温室大棚，引进的优良种质经过适应性栽培后，选择生长较好且有代表性的种质。参试的5个种质(TF、TZ、TA、TY、TD)分别来源于福建、浙江、安徽、云南、广东等地，均为农家品种。每个种质均挑选枝条较为粗壮、生长相近的6～9盆植株作为试验对象。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 结实率 盛花期挑选开花后2～3 d的铁皮石斛，参照王聪等[25]的方法，各种质分别选取6盆植株进行自花授粉、同株异花授粉、种质内异株授粉及种质间授粉。其中，自花授粉指用本花朵的花粉块进行授粉；同株异花授粉为同株不同花朵间授粉；种质内异株授粉表示同一种质不同植株的花朵间授粉；种质间授粉为不同种质的花朵间授粉。授粉时去掉唇瓣，用牙签挑取花粉块放置柱头上。每授粉1次对牙签进行消毒或更换牙签，并及时挂牌标注授粉日期、授粉朵数等。授粉1个月后统计结实率。结实率/%=(结实个数/授粉花朵数)×100。

1.2.2 座果率 根据开花特性选取开花较集中、量大且长势健壮的铁皮石斛TF、TZ、TA种质各3盆。用标签标注好花朵完全开放的日期。开花后1～6 d内进行种质间授粉，每天授粉25～30朵，授粉后及时挂牌并做好记录。采收时统计座果率。座果率/%=(采收蒴果个数/授粉花朵个数)×100。

1.2.3 蒴果形态变化 (1)随机选取TY、TA、TF、TZ种质经不同授粉方式后所得蒴果为观测对象，分别于授粉后第5天起用直尺和游标卡尺分别测量录果荚的长度和宽度，授粉后第10天第2次测定，之后每10 d观测并记录数据，直至授粉100 d。授粉100 d后统计并分析蒴果发育情况。(2)随机选取经种质间授粉的TA、TF、TZ种质，于授粉后90～210 d进行成熟度试验。解剖果荚并混合种子后，在生物显微镜(10×)下观察种子形态。部分混合后的种子经TTC染色后，在显微镜(4×)下观察染色情况，红色则为有胚种子，统计视野内有胚种子个数和种子的总个数，3次重复，并计算种子的有胚率。有胚率/%=(有胚种子个数/种子总个数)×100。

2 结果与分析

2.1 授粉方式对铁皮石斛结实率的影响

授粉方式对铁皮石斛结实率的影响见表1。由表1可以看出，5个种质均不能进行自花授粉和同株异花授粉，结实率均为0。各种质间授粉和种质内异株授粉均能成功获得蒴果，但种质间授粉结实率(87.50%～98.67%)高于种质内异株授粉(62.50%～77.78%)，说明铁皮石斛存在自交不亲和性且有较高的杂交亲和性，能够通过种质间授粉获得大量蒴果。5个种质的平均结实率分别为82.64%、83.39%、78.80%、86.20%、80.59%，可见不同种质的结实率存在差异，在后续的杂交育种组配中选择结实率较高的种质作为父母本能获得更多的杂交后代。

表1 不同授粉方式下铁皮石斛的结实率Table 1 Seed setting rate of D.officinale by different pollination methods

2.2 授粉时间对铁皮石斛座果率的影响

授粉时间对铁皮石斛座果率的影响见图1。由图1可知，铁皮石斛开花后6 d内授粉都能结果，座果率均在80%以上。在开花后2～3 d授粉，座果率最高，达100%，分别比开花后1 、4 、5和6 d高14%、11.11%、14.29%和20%。说明开花后2～3 d为最佳授粉时间，此时花粉成熟、柱头粘性较大，有利于提高座果率；开花后4～6 d授粉座果率逐渐下降，可能跟柱头粘性变差有关。

2.3 授粉时间对铁皮石斛蒴果及种子的影响

2.3.1 蒴果 铁皮石斛盛花期一般在4—5月，其蒴果近椭圆形，主要经人工授粉后获得。蒴果生长期可达6～7个月，果荚表面最初为翠绿色、有光泽，种子为深黄色结块状态，逐步变为表面黄色、稍微疲软的成熟蒴果，此时种子呈粉末分散状[26]。授粉成功的花朵会在授粉2～3 d后萎缩，第4天子房开始膨大，之后膨大逐渐明显。授粉0～100 d铁皮石斛蒴果生长曲线见图2。由图2可知，授粉5～30 d铁皮石斛蒴果快速生长，果荚长度和宽度增长快速；授粉30～60 d果荚长度进入缓慢增长阶段，而果荚宽度增长速度明显快于长度；授粉60 d，果荚生长趋于平稳，蒴果大小基本稳定。

2.3.2 种子 铁皮石斛种子黄色、较小，具种皮和种胚；呈纺锤形，两端渐狭，中部膨大，种胚位于种子中间膨大部分，为黄绿色。解剖成熟蒴果，并统计种子总数，约在5.3～23.6万粒之间。不同成熟度的蒴果解剖后种子形态见图3。授粉90 d，种子结块呈粘连状态，不易抖落；授粉120 d，部分种子为粉尘状且能少量抖落，但大部分还是结块粘连；授粉150～210 d，种子呈粉尘状且可以快速抖落，而粉状种子更适合作为无菌播种的原材料。显微镜下种子形态及染色情况见图4，在显微镜(10×)下，铁皮石斛种子构造简单，仅由1层透明的种皮和1个种胚构成，无胚乳。在显微镜(4×)下观察TTC染色后的种子，统计种子个数并计算种子有胚率发现，授粉90 d蒴果种子有胚率为81.16%，与其他天数差异显著，授粉120、150、180、210 d种子有胚率分别为96.62%、94.59%、94.50%和91.58%，均在90%以上，经SPSS方差分析差异均不显著。综合来看，以授粉150 d左右的种子进行无菌播种最佳。

3 讨论与结论

本试验通过引种各地具有优良性状的农家品种经适应性栽培后作为铁皮石斛良种选育的亲本来源，杂交亲本在空间上具有远缘杂种优势，为不同种质间杂交繁育新品种奠定了基础，同时还可以缓解野生铁皮石斛种质资源短缺的压力，对保持铁皮石斛遗传多样性具有重要作用。授粉方式、授粉时间等杂交措施以及果实发育过程的观测等研究是促进资源合理化利用的手段，也是种质资源繁育体系中不可或缺的组成部分。

3.1 不同授粉方式下铁皮石斛结实率不同

本研究表明，5个铁皮石斛种质均存在自交不亲和性。不同种质的结实率不同，虽然种质内和种质间授粉都能够结果，但种质间授粉结实率均高于种质内异株授粉，该结果与王聪等[25]的结果一致。但本试验中种质内异株授粉的结实率(62.50%～77.78%)整体偏高，而种质间授粉的结实率未达到100%，可能是由于种质间授粉更易受种质特性的影响，而种质内异株授粉的花粉来源于同一种质，只与自身的遗传特性相关，属于种内杂交。相比之下，种质间授粉可以获得较多数量的蒴果且有利于遗传多样性的保持，因此可作为铁皮石斛种质资源的利用及新品种培育的主要技术手段。

3.2 不同授粉时间下铁皮石斛座果率不同

本研究表明，授粉时间对蒴果的形成有一定的影响。开花后2～3 d授粉，座果率可达100%。通过对开花后1～6 d的花朵进行授粉发现，开花后2～3 d授粉柱头粘性较大，该结果与李景蕻等[3]、王怀青[27]的结果一致。开花后4～6 d授粉，座果率逐渐下降，可能与花粉活力下降、柱头粘性变差有关，还需要进一步对不同开花日期的花粉活力进行跟踪测定。

3.3 蒴果的发育及种子形态

蒴果发育过程中(授粉30 d内)果荚的长度和宽度均先快速增长；授粉30～60 d，果荚进入缓慢增长阶段，但宽度增长速度明显快于长度；授粉60 d，蒴果大小基本稳定，此蒴果发育的整体趋势与朱波等[10]结果相一致；授粉100 d，蒴果形态特征无明显变化。授粉150 d左右种子完全成熟，呈粉末分散状，有胚率为94.59%，更适合于无菌播种，后续也可进一步研究无菌播种的萌发率，以确定杂交种子的活力。

利用杂交等技术培育出高药用价值、抗病虫害的优良品种是铁皮石斛的育种目标[28]。授粉方式、授粉时间、蒴果发育情况的研究为获得适宜福建省种植的优良品种奠定了基础，但有关铁皮石斛杂交后代的培育和有效成分的测定，以及对其性状的持续观察和引进并筛选出优良品种以扩大亲本选配的范围等还有待进一步研究。