石斛属植物再生及遗传转化研究进展

夏 科, 吴巧芬, 赵志国, 蒋庆鸿, 仇 硕

(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西 桂林 541006)

石斛属(DendrobiumSwartz)为兰科(Orchidaceae)三大属之一，其原种将近2 000种，我国约60多种[1]。石斛属植物有白色、黄色、绿色、粉红色、粉紫色、紫红色、红棕色和棕色等诸多花色，形态各异，具有很高的观赏价值，是世界“四大观赏洋兰”之一，也被誉为“父亲节之花”。石斛属植物含有石斛碱、石斛铜碱、石斛胺等多种生物碱类中成药成分，其中铁皮石斛更被誉为“中华九大仙草”之首[2]。因而，石斛属植物是一类兼具观赏和药用价值的重要植物，备受消费者钟爱。

早期，国内对石斛属植物的研究主要集中在资源调查与引种栽培[3]、分类鉴定[4]、杂交育种[5]、组织培养[6]、花期调控[7]等方面，并取得很多重要的研究成果。近年来，随着生物学技术的不断发展，已利用分子生物学技术开展石斛属分类鉴定[8]、基因的克隆与分析[9]、遗传转化[10-11]等研究。成熟的组织培养体系是进行遗传转化研究的基础，随着组织培养技术在石斛属植物中的广泛应用, 其基因工程研究也取得了很大进展[12-14]。本文从石斛属植物再生体系建立及遗传转化等方面进行概述，探讨了目前遗传转化存在的问题并提出解决方案，分析了石斛属植物的组织培养未来发展趋势和商业化生产应用，以期为石斛属植物分子生物学相关的研究以及基因工程培育新品种奠定基础。

1 石斛属植物组织培养及再生体系的建立

1.1 培养基质及植物生长调节剂

自1937年第1个植物组织培养基诞生以来，已衍生出上千种培养基[15]，但能满足多数物种常用的培养基种类却相对较少，主要有White、MS、B5、SH、N6、NN、DKW、WPM、H、Miller、Heller、ER、NT、LS等14种[16]。石斛属植物组织培养以MS和1/2MS培养基为主，在培养基中加入适当的天然提取物，如椰子汁[17]和香蕉泥[18]等，对石斛原球茎的形成及生长有较大的促进作用。石斛属植物组织培养过程中常需要添加外源植物生长调节剂，如NAA、BA、KT等，其对外植体的诱导、增殖分化、生根、发芽均起到关键性的作用[19]。植物细胞分裂、诱导器官形成和次生产物的合成所需植物生长调节剂的种类、配比和浓度不同，因此不同的石斛品种应选择合适的1种或多种植物生长调节剂进行诱导。此外，培养基中加入适量的生物胺，能促进铁皮石斛的原球茎转化为芽[20]。目前，石斛属已有多种组培快繁的成功报道，如铁皮石斛[21]、秋石斛[22]、翅萼石斛[23]和报春石斛[24]等。

1.2 外植体材料的选择

目前，石斛属组培苗大多通过诱导外植体形成原球茎(类原球茎)，然后分化培养产生芽或者丛生芽而获得。陈齐明等[25]研究表明，石斛属茎尖和侧芽顶端分生区细胞的分裂能力强，容易诱导出原球茎；明兴加等[26]认为，利用假鳞茎可诱导出腋芽。虽然茎尖、侧芽和茎段都是高质量的外植体，但其来源有限，特别是对于珍稀石斛品种，很可能丧失母本。石斛种子可进行非共生萌发，目前已有多个物种通过无菌播种技术进行工厂化生产，如铁皮石斛[27]、竹叶石斛[28]和兜唇石斛[29]等，但利用种子进行培养易产生性状分离。此外，石斛属植物的根、叶、茎段等部位也可以作为外植体进行诱导，但成功率较低或者难度较大。目前，已有利用根尖作外植体进行诱导的成功报道[30]，但根部因有大量的内生菌，较难脱毒，易污染。而以叶片和茎段作为外植体具有母本伤害小、数量大、取材不受季节影响等优势，但诱导率较低，叶片诱导率仅1.95 %～11.99 %，茎段仅1.02%～35.57%[31]。

外植体的选择是能否成功诱导原球茎的关键，选取较幼嫩且生长旺盛的部位作为外植体是诱导原球茎形成的理想来源，如茎尖、侧芽、茎切段和种子等。

1.3 离体培养条件

无论是在自然条件还是在离体培养条件下，植物的光和温度信号都是互相联系的[32]。不同的光照和温度等培养条件对石斛属原球茎增殖分化的影响不同[33]，可能是光照改变了激素水平从而影响原球茎增殖分化[34]。Lin et al[33]研究表明，蓝光诱导铁皮石斛原球茎的分化率最高。秦廷豪[35]研究发现，温度对铁皮石斛原球茎增殖有明显影响，低温有利于减少分生苗的数量，形成健壮高大的试管苗。Luo et al[36]发

现，低温处理可以显著提高霍山石斛原球茎的分化率。目前，石斛属植物组培快繁过程中通常选择的温度为(25±1) ℃、光照强度1 600～2 000 lx、光照时间10～12 h。

1.4 移栽驯化

张玲菊等[37]研究表明，光照强度会影响不同种源铁皮石斛的净光合速率、光补偿点和光饱和点。不同光源对石斛种苗的影响不同，如红光有利于铁皮石斛种苗根系与苗高生长，蓝光有利于茎增粗与生物碱积累，而红蓝混光(红光∶蓝光=8∶2)则有利于提高叶绿素、多糖含量及酶活性[38]。光照强度对霍山石斛生长速度影响较大，仅早晚光强较低时有光合积累[39]；光照强度还会改变金钗石斛吸收和同化CO2的途径，使其在CAM途径与C3途径间转换[40]。温度和湿度对石斛光合速率的变化也有显著影响，在不同的温度和湿度下，光照强度的变化对净光合速率的影响有较大差异[41]，从而影响石斛属植物的生长及多糖含量的积累[42-43]。此外，不同移栽基质和移栽季节对组培苗移栽成活率也有很大影响，石斛属植物组培苗移栽驯化常用的栽培基质是树皮和水苔，但需要根据具体种类或者栽培地的环境选择不同配比[23-24]。

2 石斛属植物遗传转化研究

2.1 遗传转化的受体

原球茎是兰科等少数植物特有的一种生长状态，易诱导，共培养后瞬时表达率非常高，通过诱导形成愈伤组织，可再生成类原球茎，进而再生植株，是最理想的转化受体[44]。石斛属植物遗传转化的受体大多采用原球茎或类原球茎，如铁皮石斛[45]、流苏石斛[46]、金钗石斛[47]等。此外，石斛的愈伤组织和花序顶端组织也可作为受体进行遗传转化研究，Tee et al[48]认为，转化的愈伤组织细胞不需经过愈伤化发育或胚发育阶段，能有效避免嵌合体的产生，是较理想的转化受体细胞，但其最佳转化状态难以控制。

2.2 遗传转化的方法

植物遗传转化主要有以载体为媒介的基因转移和直接转移2种方法[49]。其中，载体法需要借助农杆菌侵染才能实现外源基因的导入；直接转移法则是通过物理化学方法将目的基因直接导入受体细胞，主要包括：基因枪法、电击法、超声波法、花粉管通道法、多聚物介导法等[50]。每个物种受体的特征不一样，应选择最适的方法进行遗传转化。目前，石斛属植物遗传转化应用最多的是农杆菌介导法和基因枪法。

2.2.1 农杆菌介导法 农杆菌介导法是指将目的基因融合到农杆菌细胞中含有Ti质粒或Ri质粒的一段T-DNA(transferring DNA)，使目的基因整合到植物的染色体上[51]。虽然农杆菌介导法插入的外源基因多数为单拷贝，且具有符合孟德尔遗传规律和方法简单等优势，但该方法存在物种选择有限、易产生嵌合体、耗时、转化效率低等缺陷。

农杆菌介导法是目前石斛属植物遗传转化使用最频繁的方法之一。Uddain et al[44]研究表明，与大肠杆菌相比，农杆菌对石斛属植物原球茎的趋向性更积极。目前，用于石斛属植物遗传转化的农杆菌有：LBA4404[10]、EHA105[52]、AGL1[52]、GV3101[53]、C58[46]等，其中LBA4404和EHA105是使用最频繁和侵染能力较强的2种菌株。张妙彬等[54]研究表明，相同条件下，EHA105比LBA4404对石斛兰类原球茎的侵染能力更强。适合石斛属植物表达的载体有：pCAMBIA1301[52，55]、pCAMBIA1303[56]、pCAMBIA1304[14,57]、pCAMBIA1305[58]、pCAMBIA3301[45]、pBI121[10]、pIG121[53]等，其中使用较频繁的载体是pCAMBIA1301。抗生素在石斛属遗传转化中十分重要，会直接影响转化子的筛选。常用于石斛属遗传转化筛选的抗生素有：氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢噻肟、头孢哌酮、潮霉素和卡那霉素。Cao et al[53]研究发现，美罗培南作为一种新型抗生素比其他常用抗生素具有更高效的抗农杆菌特性。

目前，农杆菌介导的遗传转化研究在一些石斛杂交种[10]、金钗石斛[52]、春石斛[59-60]、密花石斛[61]、铁皮石斛[62]和流苏石斛[46]等石斛属植物中已见报道。Yu et al[10]将反义DOH1序列导入石斛兰并成功获得转基因植株，通过验证发现植株出现多芽发育异常表型；李凤华等[63]利用发根农杆菌转化金钗石斛茎、叶片和叶柄，并成功诱导出石斛毛状根，此结果将为石斛生物碱的工业化生产奠定基础；张振华[64]将建兰的花叶病毒外壳蛋白基因(CyMV-CP)成功导入秋石斛的2个品种体内，开创了石斛属抗花叶病毒的研究先河；崔波等[45]将ACC合成酶反义序列成功导入铁皮石斛；黄超群[46]和杨翠芹[47]利用正交设计方案优化石斛属遗传转化体系，对研究石斛属品种的遗传转化具有重要的参考价值。

2.2.2 基因枪法 基因枪法又称粒子轰击细胞法或微弹技术，是把粘有DNA的细微金粉打向细胞，整合到植物染色体上，完成基因转移[65]。该方法具有不受受体类型限制、操作简单省时、可控度高、瞬时转化频率相对较高等优势，但存在价格昂贵、后代遗传不稳定等缺陷。1992年，Kuehnle et al[66]最早采用基因枪法转化石斛兰并成功获得转化子，此后该方法被应用于多种石斛属植物遗传转化。Chia et al[67]利用基因枪法将luc标记基因导入石斛兰原球茎，并首次成功获得转化植株；密花石斛、金钗石斛和蝴蝶石斛也用该方法成功获得转基因植株[55,68]；杨雪飞[12]利用基因枪法将大麦抗旱耐盐基因LEA3导入铁皮石斛原球茎，成功获得抗旱耐盐新品种。

目前，农杆菌介导法和基因枪法已应用于多种石斛属植物遗传转化，但相对于双子叶植物和被子植物，其转化效率较低，一般瞬时转化频率不超过60%，而通过抗生素筛选后，获得抗性植株的概率更低[55，59]。崔波等[45]研究表明，不同农杆菌浓度和AS浓度对铁皮石斛原球茎的GUS瞬时转化率分别为0～22.22%和9.52%～58.82%；Yu et al[68]利用基因枪转化Dendrobiumhybrid时发现，通过潮霉素筛选后，仅得到5%～10%的抗性植株；Men et al[55]研究蝴蝶石斛和金钗石斛遗传转化时发现，经潮霉素筛选后，分别得到12%和2%的抗性植株。因此，如何提高石斛属植物的转化效率仍是当前亟待解决的问题。

2.2.3 兰科植物其他遗传转化方法 兰科作为一个进化程度较高的大科，至今已开展很多遗传转化的研究，除利用上述两种常见的遗传转化方法外，还有利用其他转化方法的研究报道。Steinhart et al[69]应用PEG介导法转化万带兰花的原生质体，22 h后检测到GUS的瞬时表达；Griesbach et al[70]使用电激发法，以虾脊兰为受体材料，导入GUS并获得转基因植株。但石斛属植物利用其他转化方法的报道较少，冼康华等[71]将携带GFP和GUS报告基因的载体通过花粉管通道成功转化了铁皮石斛。

3 石斛属植物再生及遗传转化产业化应用

石斛属植物多为名贵的观赏和药用植物，多数品种已建立成熟的再生体系。国外多年前已对观赏类的石斛兰进行产业化开发，日本20世纪60年代就设立了专门的兰花研究机构，成立高度集约化生产的株式会社，效益显著[72]；泰国于1967年开始进行石斛兰切花产业化生产，已成为世界上最大的兰花出口国[73]。我国海南因其得天独厚的地理优势成为发展石斛兰(主要是观赏类秋石斛)的主要基地，多通过科研院校联合企业开发，规模化生产不断扩大，经营多种石斛兰[74]；云南省是我国药用类石斛主产区，其产量占全国总产量的70%以上[75]，建立了铁皮石斛、紫皮石斛、鼓槌石斛和流苏石斛等成熟的组织快繁技术，并进行工厂化种苗生产[76]；安徽的霍山石斛通过“胚培养—原球茎—完整植株”的快繁模式实现了种苗的规模化快速繁殖[77]；近年来，独角石斛[78]和串珠石斛[79]等多个种的组培快繁技术体系也达到了规模化生产的水平。然而，石斛组培快繁技术在产业化生产应用上仍然存在培养周期较长，过程繁琐，人力、物力成本较高等问题，今后应加强缩短种苗培养周期及提高生产效率等方面的研究。

石斛属植物大部分种类遗传转化体系不成熟，仍存在转化效率低以及转基因植株难获得等难题，使得石斛属很多基因功能的研究只能转向模式植物，如花器官发育相关基因功能研究，只能利用拟南芥进行转

基因功能验证[80-81]。目前仅有少数成功的转基因报道，如利用基因枪法将LEA3导入铁皮石斛并成功获得抗性植株的研究[12]。石斛属植物遗传转化体系不成熟的问题严重制约了很多基础理论的研究以及基因工程的应用发展，今后应持续加大科研力度。

4 展望

成熟的组织培养再生体系及稳定高效的遗传转化体系是获得转基因植株的关键。石斛属植物多为名贵的观赏和药用植物，目前已建立成熟的再生体系，也开发了SSR等分子标记[82]，但其遗传转化体系还存在许多难以解决的问题，如多数种类遗传转化体系不稳定，仍然存在转化效率低以及很难获得转基因植株等问题。而诸如研究花发育、花色、花香、抗逆性等相关的基础理论以及通过转基因工程培育优良品种等，均会利用遗传转化这一关键环节。因此，针对目前研究现状，提出如下建议：

(1)完善农杆菌介导转化法。进一步研究农杆菌介导转化法的影响因素，包括受体处理方式、农杆菌侵染时间、AS添加量、共培养时间、抗生素的选择及用量、最佳培养方式等，以确定适合不同品种的最佳转化条件。(2)将农杆菌介导法与基因枪法相结合，提高转化效率。建立一套新的遗传转化途径，包括农杆枪法[83]、基因枪轰击/农杆菌感染法[84]、以金粉或钨粉包裹菌体作为微弹的轰击法[85]等。(3)探索其他植物遗传转化方法。目前，有关植物遗传转化的方法还包括：花粉管通道法、真空渗入法、茎尖转化法、超声波辅助的农杆菌转化法、碳化硅纤维介导法、叶绿体转化法以及藻酸钙微珠介导法等[86]。同时，可以借鉴一种应用于拟南芥的新型遗传转化方法——蘸花法，该法能有效避开植物组培，具有转化效率高、重复性好、省时省力等优点[87-88]。探索新的遗传转化方法可以弥补农杆菌介导法和基因枪法的缺点，使其更加适用于石斛属植物的遗传转化，提高转化效率。