4种芳香植物精油对竹林病原真菌的抗菌性*

王安可 毕毓芳 温 星 王玉魁 蔡函江

(国家林业和草原局竹子研究开发中心 竹子资源与利用国家林业和草原局重点实验室 杭州 310012)

真菌病害大约占整个植物病害的70%～80%(邵淑君， 2016)，在植物病害中危害最重、影响最广。竹林的真菌病害主要有毛竹枯梢病、基腐病、竹秆褐腐病、竹叶锈病、竹秆锈病、竹黑粉病、竹赤团子病、竹肉球病、竹黑痣病、竹丛枝病等。

芳香植物是具有香气和可供提取芳香油[又称植物精油(plant essential oil)]的栽培植物和野生植物的总称。植物精油是植物体内的次生代谢物质，化学组成较为复杂。在医学领域，植物精油在去痛、降压、消炎、提高免疫力、抗菌和保健等方面得到了广泛的应用。在病虫害防治方面，植物精油具有对病原物和害虫生物活性很高，又不易产生抗药性，且对人畜毒性很小、不污染环境等优点，是一种很好的生物农药原料。

目前已经发现许多对植物病原真菌有抑制作用的植物精油(Zuzarteetal.， 2012; Marongiuetal.， 2012),如:菊花(Chrysanthemumviscidehirtum)、斯里兰卡肉桂(Cinnamomumzeylanicum)、大西洋雪松(Cedrusatlantica)、叙利亚芸香(Rutachalepensis)、柠檬马鞭草(Lippiacitriodora)和唇萼薄荷(Menthapulegium)精油对植物病原真菌指状青霉菌(Penicilliumdigitatum)、柑橘褐腐疫霉(Phytophthoracitrophthora)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、柑橘酸腐病菌(Geotrichumcitriaurantii)有抑制作用(Bouchraetal.， 2003); 百里香(Thymusvulgaris)、薄荷(Menthapiperita)和亚香茅(Cymbopogonnardus)精油对鳄梨(Butyrospermumparkii)和桃(Amygdaluspersica)的病原菌胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、匍茎根霉菌(Rhizopusstolonifer)和扩展青霉菌(Penicilliumexpansum)均具有优良的抗菌力(Sellamuthuetal.， 2013)。此外，丁香蒲桃(Syzygiumaromaticum)、肉桂(Cinnamomumcassia)、天竺葵(Pelargoniumhortorum)、月桂(Laurusnobilis)、互叶白千层(Melaleucaalternifolia)、薄荷(Menthahaplocalyx)、八角(Illiciumverum)、柑橘(Citrusreticulata)和藿香蓟(Ageratumconyzoides)等精油对十余种常见的农业病原菌都有抗菌活性(Kishoreetal.， 2007; Huangetal.， 2010; 吴建挺, 2013; 宁蕾等, 2012; Singhetal.， 2016)。

笔者研究了4种芳香植物精油对12种竹林病原真菌的抗菌能力，以期为利用植物精油防治竹林病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

互叶白千层(又名茶树,tea tree)、香茅(Cymbopogonnardusvar.lenabatu)、肉桂和大蒜(Alliumsativum)精油均购自莉微儿(深圳)贸易有限公司。根据徐梅卿等(2006)关于中国竹类病害的记录，选取中国林业微生物保藏管理中心(CFCC)已保藏的12种竹林病原真菌(表1)作为供试菌种，上述菌种均购自CFCC。天然化学提取物均购自百灵威科技股份有限公司。

表1 12种竹源致病真菌Tab.1 Twelve kinds of bamboo pathogenic fungi

1.2 方法

选用4种常见的芳香植物互叶白千层、香茅、肉桂和大蒜，并挑选出12种竹林病原真菌进行最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小杀真菌浓度(minimal fungicidal concentration，MFC)试验。此外还对精油的主要化学组分松油烯-4-醇、香茅醛、香茅醇、香叶醇、反式肉桂醛、二烯丙基硫醚和二烯丙基二硫醚的抗菌性能进行测试。

1.2.1 植物精油化学组分检测 委托苏州禾川化学技术服务有限公司按照国家标准GB/T 11538—2006《精油 毛细管柱气相色谱分析 通用法》对精油进行检测，用面积归一化法计算主要成分含量。

1.2.2 菌种悬浮液的制备 将12种真菌的菌丝体(初代菌丝体由CFCC提供)接种在含PDA培养基的90 mm培养皿中，温度28 ℃、湿度80%±5%、暗培养7天。将培养基表面的菌丝转移到已灭菌的研钵中，加少许无菌生理盐水稍许研磨，后使用无菌棉球过滤，制备成悬浊液。使用血球计数板计数，根据结果将各菌悬浮液稀释到终浓度为1×106个·mL-1，4 ℃保存备用。

1.2.3 精油的乳化处理 由于精油未经乳化无法融入培养基，所以在培养基中添加精油或化学组分之前需要使用3%聚乙烯醇对其进行乳化。在加入培养基之前，将其与3%聚乙烯醇1∶1进行混合，然后再将乳化后的精油或化学组分根据需要加入培养基混合。

1.2.4 MIC和MFC的确定 PDA培养基在高温灭菌后50 ℃时根据试验设计体积分数加入乳化后精油，混合均匀后趁热倒入48孔板，冷却2天后观察无污染可接种使用，每孔接种菌种悬浮液2 μL，28 ℃暗培养。试验设计体积分数为0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.5%、2.0%。试验时从低体积分数开始，当MIC和MFC出现后，不再测试更高体积分数，每个处理4个重复。MIC的判定标准为： 当CK开始生长时，所试体积分数中菌种未开始生长的最低体积分数为MIC； MFC的判定标准为： 所试体积分数中10天内菌种未生长的最低体积分数。

1.2.5 精油与内含化学成分抗菌能力的测定 选择合适体积分数(在MIC和MFC之间)的精油和主要化学组分对12种菌进行抗菌比较试验，每个处理重复3次。具体处理体积分数为： 肉桂0.01%(黑附球菌与竹针孢座囊菌采用肉桂0.02%)，大蒜0.05%，香茅0.1%(链格孢菌采用香茅0.03%)，互叶白千层0.1%(包括尖孢枝孢、链格孢、出芽短梗霉、黑附球菌与竹针孢座囊菌)和0.5%(其余7种菌)； 反式肉桂醛为肉桂精油的主要成分，体积分数与其相同，二烯丙基硫醚和二烯丙基二硫醚是大蒜精油的主要成分，体积分数与其相同，香茅醛、香茅醇和香叶醇是香茅精油的主要成分，香茅醛体积分数与其相同，香茅醇和香叶醇体积分数为香茅的25%，松油烯-4-醇是互叶白千层精油的主要成分，体积分数与其相同。

将100 μL菌种悬浮液接种到90 mm PDA培养皿中(推棒涂匀，尽量保证培养基每个角落的菌种数量一致)，温度28 ℃、湿度80%±5%、暗培养7天。用7 mm打孔器将生长好的菌分割，分割好的菌块在同一时间接种到配置好的含有不同体积分数精油和化学成分的培养皿中(培养基配置方法同1.2.4)，28 ℃暗培养。连续记录菌体的生长直径，直到菌体生长直径大于8 cm或者生长时间超过12天时停止记录。

2 结果与分析

2.1 精油的化学成分

2.1.1 互叶白千层精油的化学成分 本研究中使用的为松油烯-4-醇型白千层油，其组分和含量见表2。这些主要组分基本符合国际(ISO 4730: 2017)和国内标准(GB 1886.270—2016)。

表2 互叶白千层精油的化学成分Tab.2 Compositions of tea tree essential oil

市面上多数的白千层精油(又名茶树精油)原料为互叶白千层，但包鳞白千层(M.bracteata)、白油树(M.quinquenervia)、石南叶白千层(M.ericifolia)、绿花白千层(M.viridiflora)、白千层(M.leucadendron)、散花白千层(M.dissiliflora)和轮叶白千层(M.linariifolia)等也可以作为白千层油的原料(梁忠云等， 2012)。白千层精油根据主成分的不同可分为不同的化学类型(不依赖植物学分类)，如松油烯-4-醇型、γ-松油烯型和桉叶素型等(Homeretal.， 2000)； 这些类型的不同与引种地和栽培环境有密切的关系(陈海燕等， 2003)。

2.1.2 香茅精油的化学成分 香茅精油的主要成分和含量见表3，根据试验结果，笔者认为本试验所用精油更符合爪哇型，尽管采购时精油的标签拉丁名是斯里兰卡型。

表3 香茅精油的化学成分Tab.3 Compositions of citronella essential oil

目前市面上香茅精油主要分为2种： 爪哇型(Java type，Cymbopogonwinterianus)和斯里兰卡型(Sri Lankan type，Cymbopogonnardusvar.lenabatu)。国际上对这2种不同的香茅精油也制定了相应的标准： 爪哇型ISO 3848：2016，斯里兰卡型ISO 3849: 2003。这2种香茅精油在成分上有很大的区别，尤其是香茅醇和香茅醛的含量。爪哇型香茅中香茅醛的含量最少不能少于31%，但斯里兰卡型香茅中香茅醛的含量最大为6%； 香茅醇的含量也是如此，爪哇型的最小值8.5%是斯里兰卡型的最大值； 爪哇型香叶醇含量为20%～25%，斯里兰卡型为15%～23%。

2.1.3 肉桂精油的成分分析 经检测，本试验用的肉桂精油中含有80.72%的反式肉桂醛，此外还检测到13.9%的水杨酸甲酯，但该成分在各个标准(包括国标GB 1886.207—2016)中都没有提及。

与香茅类似，主流的肉桂精油分为中国型(Chinese type,C.cassia)和斯里兰卡型(Sri Lankan type,Cinnamomumzeylanicum)。国际上对应的精油标准分别为ISO 3216: 1997(Oil of cassia)和ISO 3524: 2003(Oil of cinnamon leaf)。2种精油在成分上并没有较大的区别，主要成分都是反式肉桂醛，只是中国型规定反式肉桂醛的最高含量为88%，斯里兰卡型为83%。

2.1.4 大蒜精油的化学成分 大蒜精油的化学成分及含量见表4。目前ISO并没有针对大蒜精油的标准，只有对干燥蒜的标准。我国对大蒜油的标准(GB 1886.272—2016)中并未对关键成分进行说明和规定。

表4 大蒜精油的化学成分Tab.4 Compositions of garlic essential oil

本次的检测结果与Zhao等(2013)对大蒜精油测定的结果(二烯丙基三硫醚50.43%、二烯丙基二硫醚25.30%和二烯丙基硫醚6.25%)类似。

由于精油是植物采摘后蒸馏而成，其主要成分的种类和数量与植物的品种、生长环境、采摘季节和蒸馏方式有密切的关系。所以也导致不同批次精油的成分一定的差异。作为研究用途时，须对每一批次的样品进行成分鉴定分析，根据标准作出是否可用的判断。经过分析，本试验中所用的精油可以用于试验。

2.2 4种芳香植物精油对12种致病真菌的抗菌力(MIC和MFC)

从表5可以看出，总体上12种致病真菌对4种精油的抑制敏感度(以MIC来判断)从强到弱依次是肉桂、大蒜、香茅和互叶白千层。肉桂精油的MIC多为0.005%，只有对长蠕孢和竹针孢座囊菌的MIC为0.010%； 大蒜精油对7种菌的MIC为0.005%，对4种菌的MIC为0.010%，对暗色节菱孢的MIC较高为0.200%； 香茅精油的MIC为0.005%～0.03%； 互叶白千层精油的MIC为0.03%～0.2%。

表5 4种芳香植物精油对12种真菌的MIC和MFC①Tab.5 MIC and MFC of 4 essential oils on 12 fungi %

以MFC为依据，抗菌活性从强到弱依次为肉桂、香茅、互叶白千层和大蒜精油。肉桂精油除了对尖孢枝孢的MFC为0.1%外，对其他11种菌的MFC均在0.01%～0.04%； 香茅精油除了对链格孢的MFC为0.04%外，对其他11种菌的MFC均为0.2%～0.5%； 互叶白千层精油的MFC为0.2%～1.5%； 大蒜精油的MFC为0.1%～1.5%，但有2个菌的MFC超出试验体积分数2.0%。

MFC/MIC的值在医学上可以作为耐药性的一个指标。本试验中，肉桂和互叶白千层精油耐药性较好，香茅精油次之，大蒜精油最差。肉桂精油对尖孢枝孢的MFC/MIC为20，对其余11种菌的MFC/MIC在1～8； 互叶白千层精油对长蠕孢的MFC/MIC为30，对尖孢枝孢的MFC/MIC为33，对腐皮镰刀菌的MFC/MIC是50，对其余9种菌的MFC/MIC为4～8； 香茅精油的MFC/MIC为10～40； 大蒜精油的MFC/MIC比较分散，范围在10～300之间。

综上所述，对于供试的12种真菌，以菌对药剂的敏感程度(MIC数据)为据，敏感度从强到弱依次是肉桂、大蒜、香茅和互叶白千层精油； 以致死剂量(MFC数据)为据，杀菌力从强到弱依次是肉桂、香茅、互叶白千层和大蒜； 以菌对药剂的耐药性(MFC/MIC数据)为据，优先次序是肉桂、互叶白千层、香茅和大蒜。整体上，肉桂精油的抗菌力最好； 其次是香茅，再次是互叶白千层，大蒜较差。

这一结果与李文茹等(2013)相关研究认为几种精油抗真菌活性由强到弱依次是肉桂、大蒜、丁香、香茅和迷迭香(Rosmarinusofficinalis)的观点类似。尽管Dimic等(2015)曾指出与柠檬(Citruslimon)和香菜(Coriandrumsatium)精油比，肉桂精油的抗菌力并不突出，但在Viollon等(1994)和本研究中肉桂精油的抗菌力表现突出，都强于其他供试精油。香茅精油曾被多位研究者指出具有良好的生物农药潜力，如Chen等(2014)成功将香茅精油应用于防治樱桃番茄(Lycopersiconesculentum)病原菌链格孢，不仅降低了发病率并且对果实没有影响。Nagendra等(2010)证实0.015%的香茅精油可以完全抑制印度楝(Azadirachtaindica)病原菌拟茎点霉(Phomopsisazadirachtae)的生长，并且它的抗菌力强于柠檬草(Cymbopogoncitratus)、紫丁香(Syringaoblata)、柏木(Cupressusfunebris)和薄荷(Menthahaplocalyx)精油。

2.3 4种芳香植物精油主要化学成分的抗菌力

2.3.1 肉桂精油的有效抑菌成分 肉桂精油的主要成分是反式肉桂醛，其含量一般在80%左右。如图1所示，反式肉桂醛抑菌能力要强于同体积分数的肉桂精油(在对丝核菌、链格孢菌和竹针孢座囊菌时，抑菌能力几乎相同)，可以肯定反式肉桂醛是肉桂精油的有效抑菌成分。

图1 4种精油及有效成分抗菌力比较Fig.1 Comparison of antimicrobial activity of 4 essential oils and their active components

Singh等(2007)也证实反式肉桂醛是肉桂皮精油的主要成分，并且与肉桂精油具有同样的抗菌活性。Wang等(2005)发现反式肉桂醛高含量(76%和81%)的土肉桂(Cinnamomumosmophloeum)精油比低含量(8%)的肉桂油具有更高的抗菌力，从另一方面说明反式肉桂醛是抗菌的主要有效成分。

2.3.2 香茅精油的有效抑菌成分 香茅精油的主要成分是香茅醛、香叶醇和香茅醇，含量分别为45%、22%和15%。在初期预试验时，0.01%的香叶醇和香茅醇均能非常强烈抑制这12种菌的生长，所以在正式试验时，将这2种成分的体积分数降为香茅精油的25%(该体积分数更接近香茅精油中这2种成分的实际含量)。

试验结果(图1)表明，除了香茅醛对镰刀菌和黑附球菌无效外，香茅醛、香叶醇和香茅醇对其他菌均有不同程度的抑制作用。并且，香茅精油与同体积分数的香茅醛和自身体积分数25%的香叶醇和香茅醇相比，抑菌效果最好(除尖孢镰刀菌之外)。这说明香茅醛、香叶醇和香茅醇是香茅精油抑菌的有效成分，并且它的抑菌效果是3种成分协同作用的结果(但不排除其他微量成分也有抑菌贡献)。

该结果与Saikia等(2001)的研究结果类似，他发现香茅醛、香茅醇和香叶醇对石膏样小孢子菌(Microsporumgypseum)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)和申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)都有抗菌作用，并且与香茅油相比，香叶醇和香茅醇的抗菌力更强。但Nakahara 等(2003)研究发现，香茅醛和芳樟醇对3个曲霉属(Aspergillus)真菌、3个散囊菌属(Eurotium)和4个青霉菌属(Penicillium)有明确的抗性； 香茅醇和香叶醇对上述菌种并没有抑菌活性。

2.3.3 大蒜精油的有效抑菌成分 大蒜精油的主要化学成分是二烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基硫醚，在本试验中它们的含量分别是60.27%、32.06%和7.67%。非常遗憾的是，由于二烯丙基三硫醚未采购到(价格昂贵，且均需进口订购)，本试验并未对其抗菌的有效性进行试验。

在本试验中与大蒜精油同体积分数的二烯丙基硫醚，对试验中的9种菌没有任何抑菌效果，对其他3种菌抑菌效果微弱； 二烯丙基二硫醚对试验中的3种菌没有任何抑菌效果，对其他9种菌有一定的抑菌作用，但抑菌力均不如同体积分数的大蒜精油。由此可见，二烯丙基二硫醚和二烯丙基硫醚虽具有一定的抗菌力，并不是大蒜精油中的主要抑菌成分。

Avato等(2000)发现当少量的二烯丙基二硫醚(1%)与大量的二烯丙基三硫醚(88%)结合对3种酵母菌的生长的抑制作用有协同作用，其抑菌作用强于二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚。Tsao等(2001)比较了大蒜精油、二烯丙基硫化物、二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物和二烯丙基四硫化物对40个野生型金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的MIC，结果发现抗菌力从强到弱是二烯丙基四硫化物、二烯丙基三硫化物、二烯丙基二硫化物、二烯丙基硫化物和大蒜精油。

综上所述，二烯丙基硫化物都有一定的抗菌作用，硫化数越高抗菌性可能越强，并且它们之间的抗菌性可能有拮抗和协同作用。

2.3.4 互叶白千层精油的有效抑菌成分 互叶白千层精油的主要成分松油烯-4-醇在本试验中含量为53%。松油烯-4-醇在对9种菌的试验中抑菌效果明显强于同体积分数的互叶白千层精油； 对丝核菌、链格孢菌和竹针孢座囊菌的试验中，与同体积分数精油抑菌效果相似。

Terzi 等(2007)对互叶白千层精油及其主要组分松油烯-4-醇、γ-松油烯、1，8-桉叶素的抗菌性进行对比，发现这3种组分对黄金镰刀菌(Fusariumculmorum)、麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea)和禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)均有抑制作用，其中松油烯-4-醇型尤为突出。Mondello 等(2006)在对互叶白千层精油、松油烯-4-醇和1，8-桉叶素的抗菌(Candidaspp.)性比对时发现，松油烯-4-醇具有极强的抑菌功能，但1，8-桉叶素在所试体积分数(4%)内没有发现有抑菌效果。由此，可以肯定的是松油烯-4-醇是互叶白千层精油抗菌的主要活性成分。

3 讨论

本研究发现，肉桂、香茅和互叶白千层精油对12种供试竹林病原真菌的抗菌性能较好，大蒜精油杀菌活力和耐药性都较差。肉桂是一种出油率高、较容易获得的食用型精油原料，将其开发为生物农药的安全性和可行性都较高。肉桂还是一种可以在竹林中进行套种的高大乔木，套种不仅可以促进竹林的生长和增加竹林的经济效益，并且可能降低竹林的真菌病害。香茅精油在本研究中也表现出优良的抗菌能力，并且对宿主植物的影响较小，也被多位研究者(Sellamuthuetal.， 2013; 吴建挺, 2013)证实具有开发成生物农药的潜质。互叶白千层精油的抗菌力与肉桂和香茅精油比较差，且经济成本较高，一般用作高端杀菌剂，并不适宜开发成生物农药。

虽然本研究确定了4种精油的有效抗菌成分，但是这些有效成分现在并不适合用作开发生物农药。一是由于这些成分均为天然成分，目前只能通过生物提取，经济成本非常高； 二是精油的抗菌能力并不是单纯的由这些抗菌成分而表现的，精油内在各成分的协同和配比是精油发挥抗菌作用的关键。因此，精油比这些单一的化学物质更适合开发为生物农药。

此外，本文只是初步研究，将精油制成生物农药还需要进一步深入研究其使用方法和配比。例如，Suhr 等(2003)曾提出精油的抗菌力与使用方法有很大的关系，例如含酚类较多的精油(肉桂、丁香等)通过液体直接接触使用时的抑菌效果要强于气态蒸发，但含有柠檬醛等的精油气态的抑菌效果要强。又如Giordani 等(2006)将两性霉素B与肉桂精油联合使用，以期开发毒性更小、药效更强的药品。

4 结论

本文选取12种竹林病原真菌，通过对肉桂、香茅、大蒜和互叶白千层精油及化学组分抗菌力的研究发现： 肉桂、香茅、互叶白千层和大蒜精油均可以不同程度地抑制供试竹林病原真菌的生长。其中，病原真菌对4种植物精油的敏感度从强到弱依次是肉桂、大蒜、香茅和互叶白千层； 4种植物精油对病原真菌的杀菌活力从强到弱依次是肉桂、香茅、互叶白千层和大蒜； 病原真菌对4种植物精油的耐药性从低到高依次是肉桂、互叶白千层、香茅和大蒜。综合以上结果，综合评价4种精油的抗菌性能依次是肉桂、香茅、互叶白千层和大蒜。其中肉桂和香茅精油在未来竹林病害防治的应用中有很大的潜力。

此外，肉桂精油的有效抗菌成分是反式肉桂醛，香茅精油的有效抗菌成分是香叶醇、香茅醇和香茅醛，互叶白千层精油的有效抗菌成分是松油烯-4-醇，大蒜精油的有效抗菌成分是二烯丙基硫化物。这些抗菌成分之间的协同作用以及微量或未知成分的作用需进一步研究。