同园环境中不同海拔中华蟾蜍的心脏相对大小：海塞规则是否适合外温动物？

李苹，谭松，姚忠祎，傅金钟，陈竞峰

(1.中国科学院成都生物研究所，成都610041；2.中国科学院大学，北京100049；3.圭尔夫大学，圭尔夫ON N1G 2W1，加拿大)

海塞规则(Hesse’s rule)认为，在寒冷环境下，动物的能量代谢需求会增加，心脏与体质量之比会大于生活在温暖环境中的同种(或近缘种)动物，这一规则也被称为心脏-体质量规则(Hesse，1937；Hammondetal.，1999；Mulleretal.，2014；Cardilinietal.，2016)。此规则的生理学基础是增加心脏的相对大小能提高每博输出量和毛细血管中的循环血量，从而保证在低温等环境条件下为身体各器官提供充足的氧气和营养物质供应，同时把CO2、乳酸和其他代谢产物及时有效地排出体外(Mulleretal.，2014；Shirkey &Hammond，2014)。除了心脏，与代谢关系密切的其他内脏器官(肺、肝、肾)的相对大小也可能受环境温度影响，但这些内脏器官的变化模式与心脏的变化模式的相似程度，取决于它们与心脏功能的关联程度(Nespoloetal.，2002；Canale &Henry，2010)。

海塞规则的实验例证主要来自于内温动物。外温动物与内温动物在代谢生理上差异巨大(Gilloolyetal.，2017)。因此我们预期，内温动物与外温动物在心脏形态适应高海拔环境方面可能存在差异。低温和低氧是高海拔环境下最重要的环境胁迫因素。一般认为，高海拔环境条件下，低氧将抑制外温动物的代谢强度，潜在地降低心脏大小(Boutilieretal.，1997；Trzcionkaetal.，2008；Lietal.，2016；Storey &Storey，2017)，而低温将增加心脏大小及肌肉中红肌的比例(Young &Egginton，2011)。因此，外温动物心脏大小对高海拔的适应是应对低温和低氧双重胁迫后的综合表现，但已有的研究结果存在明显分歧(Zhongetal.，2017；Zhaoetal.，2019)，这些分歧可能部分源于表型方差的解析程度。外温动物的心脏大小不但受遗传因素影响，也受环境因素制约，分离遗传和环境效应的常用方法是同园实验(common garden experiment)。同园实验中，相似的环境条件剔除了环境方差，不同物种或种群的组间方差很大程度上可归因于遗传效应；若利用人工繁殖的子代进行实验，则克服了母体效应、发育可塑性等干扰，若仅采用野外驯化个体开展实验，组间方差中则包括了遗传和发育可塑性水平的差异(Berven，1982；Martinetal.，2004)。

中华蟾蜍Bufogargarizans属广布种，在我国除新疆、台湾、海南均有分布(Zhan &Fu，2011；Wenetal.，2015)。分布范围跨越了极大的海拔梯度(750～3 500 m)，是研究外温动物适应高海拔环境的理想动物类群(Liaoetal.，2015；Guoetal.，2016；Yangetal.，2017)。野外研究发现，海拔对川西横断山区中华蟾蜍的心脏大小没有显著影响(Zhaoetal.，2019)，但该研究未区分表型可塑性与遗传及发育可塑性的效应。本研究采用同园实验比较不同海拔中华蟾蜍心、肺、肝等内脏器官的相对大小，其中，假设在同园环境中，与栖居于低海拔地区的种群相比，生活在高海拔地区的中华蟾蜍种群应该具有相对较小的心脏，即反海塞规则。

1 研究方法

1.1 实验动物

2018—2019年，在四川省西部山区的7个采样点捕获128只成年中华蟾蜍个体(图1，表1)。1～4 号采样点属岷江水系，为Ⅰ号样线；5～7号采样点属大渡河水系，为Ⅱ号样线。7个采样点分为：低海拔(<1 000 m)、中海拔(1 600～2 100 m)和高海拔(>2 600 m)。动物捕获后运送至中国科学院成都生物研究所动物房饲养。动物房内温度控制在20 ℃±1 ℃，光周期设定为12 h∶12 h(08∶00开，20∶00关)。中华蟾蜍单只饲养于长35.5 cm×宽25 cm×高15 cm的塑料盒内，盒内放置一块湿海绵(5 cm×7 cm)用于保持湿度、一块U形瓦片(长15 cm×宽14 cm×高7 cm)作为庇护所。以沾有钙粉(Exo Terra)的黄粉虫Tenebriomolitor喂食，每2 d喂食1次，同时清洁饲养盒。每周补喂蟋蟀1次。所有中华蟾蜍均在盒内驯化至少3个月以上(表1)。

图1 中华蟾蜍取样位点Fig.1 Sampling sites of Bufo gargarizans

表1 中华蟾蜍的7个采样点信息Table 1 Geographical information of 7 sampling sites of Bufo gargarizans

1.2 解剖取样

中华蟾蜍处死前用电子天平称量体质量(±0.01 g)，游标卡尺测量体长(±0.01 cm)。然后用MS-222溶液(0.2%，M/V)进行深度麻醉，直至其对外界刺激(用镊子夹后腿肌肉)无反应为止。处死中华蟾蜍后，分离心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脂肪体各器官，并剔除器官表面附着的结缔组织，用滤纸吸干器官表面的水分后包裹于锡箔纸内。最后将样品置于恒温干燥箱(GZX-450ASB型)内65 ℃烘48 h。各脏器的绝对干重根据烘烤前后的质量变化计算。

1.3 数据分析

首先采用Minitab 16.1.0对所有的反应变量进行Johnson转换使数据符合正态分布，然后用SPSS 20.0对转换后的数据进行模型分析。使用一般线性模型(general linear model)比较各个内脏器官质量在海拔间的差异。在模型中，将样线、海拔、性别作为固定因素，驯化时间(不同海拔的驯化时间不同)、体长(snout-vent length，SVL)作为协变量，同时把固定因素的交互作用纳入模型中，当交互效应不显著时(P>0.05)，则从模型中剔除以降低模型的复杂性。各脏器的相关性采用Pearson相关分析。

2 结果

除脾脏外，海拔对各内脏器官(心脏、肝脏、肺脏、肾脏和脂肪体)质量的影响均达到显著水平(P<0.05)：低海拔心脏、肝脏、肾脏的干重均大于中、高海拔，中、高海拔间没有差异；与低海拔相比，中、高海拔的肺脏质量有降低趋势，但只有中海拔达到显著水平(表2，表3)。另外，脂肪体干重海拔间的差异有统计学意义，但在雌性中是中、低海拔显著大于高海拔，而在雄性中是低海拔显著大于中、高海拔(海拔*性别：P<0.001)。

除肺脏和脾脏的干重无性别差异外，其他脏器的干重均为雌性大于雄性。除脂肪体外，协变量SVL均与脏器干重显著正相关。除肺脏外，各脏器干重在样线间均存在差异，且表现为岷江样线的干重大于大渡河样线的干重。除心脏和脂肪体外，肝脏、肺脏、肾脏和脾脏的干重随驯化时间有增大趋势(表2，表3)。

表3 不同海拔中华蟾蜍的测量值Table 3 Measurement of Bufo gargarizans under different altitudes

Pearson相关分析表明，心脏干重与肝脏、肺脏、肾脏、脂肪体的干重均为显著正相关(P<0.001，r为0.623～0.826；表4)，但心脏干重与脾脏干重无显著相关关系(P=0.779，r=0.023)。

表4 中华蟾蜍各器官干重的相关关系Table 4 The linear correlation between dry mass of different organs of Bufo gargarizans

3 讨论

中华蟾蜍心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脂肪体的相对质量随海拔增加而变小，但脾脏无明显变化。此结果和假设一致，即在遗传或发育水平上，心脏及其关联代谢器官随海拔增加而变小，符合反海塞规则，暗示中华蟾蜍主要是通过降低代谢负荷适应高海拔环境。

增加心脏大小可提高代谢水平，有利于哺乳动物和鸟类等内温动物获得更多的能量保证自身的存活和繁殖(Piersmaetal.，1996；Hammondetal.，1999；Cavieres &Sabat，2008；Liaoetal.，2010；Mulleretal.，2014；Gilloolyetal.，2017)。但本研究表明，中华蟾蜍的心脏沿海拔变小，提示外温动物与内温动物应对高海拔环境的模式存在差异。从进化远因分析，提高代谢水平、获得能量需要付出适合度代价：例如，随着能量代谢水平的升高，需要同化的食物资源增加，搜寻食物的时间延长、空间变大，动物可能面临更大的捕食风险；同时，更大的心脏也需要更多的能量维持。杂食性的小型哺乳动物、鸟类由于食谱较宽，可利用的食物资源丰富，运动速度快，躲避天敌能力强，增加心脏质量的适合度收益可能超过上述生态和生理代价；但两栖类等外温动物的食谱相对较窄(大多为专性食虫)，运动和迁移速度较慢，随着海拔升高，与心脏变大、基础代谢升高关联的适合度代价(如捕食风险增加)可能远超过其与代谢增加相关的适合度收益(如活动水平提高、同化能力增强)，进而驱动栖居于高海拔的外温动物进化出较低的代谢支出及更小的心脏(Sears，2005)。研究发现，野外直接取样的中华蟾蜍的心脏大小不随海拔而变化(Zhaoetal.，2019)。基于本研究的结果推测，心脏大小不同梯度间的表型相似性可能是环境因素诱导的表型可塑性与遗传或发育可塑性效应叠加所致。然而，哪些环境因素及如何在表型可塑性水平影响中华蟾蜍心脏的形态大小还知之甚少。适度饥饿可诱导中华蟾蜍心脏湿重变大(张莹等，2017)，提示食物的可利用性是一个潜在因素。

肝脏和脂肪体是两栖动物体内主要的能量贮存器官，在应对短期和长期能量应激挑战中具有重要作用(金晨晨等，2014；张莹等，2017)。高海拔或高纬度地区的个体为了应对该环境下高水平的不确定性、度过较长的冬眠期和满足随后的繁殖需求，理论上需要储备更多的能量，进化出更大的肝脏和脂肪体。例如，与低纬度地区采集的个体相比较，高纬度地区的欧洲林蛙Ranatemporaria和中国林蛙R.chensinensis均具有更大的肝脏和脂肪体(Jonssonetal.，2009；Chenetal.，2011)。然而，本研究并没有发现高海拔的中华蟾蜍具有更大的肝脏和脂肪体。这种不一致性有2种可能的解释：一是由于心脏变小，高海拔个体的能量消耗减少，因此能量储存相应下降。在林蛙中观察到的能量储存增加的现象主要与环境驯化有关，而非遗传等固定效应引起(Jonssonetal.，2009)；另一种可能性是高海拔种群能量储存增加需要环境因子和遗传因素的交互作用才能表现出来。例如，生活在高纬度地区的叙利亚仓鼠Phodopussungorus启动体脂含量变化需要光周期信号(Tupsetal.，2004)。高海拔环境下，低氧和低温对于肺脏是相互拮抗的选择压力，低氧促进肺脏变大，低温则促进肺脏变小。本研究中，中华蟾蜍的肺脏随海拔升高而变小，提示其主要是受到低温的选择作用。此外，中华蟾蜍肾脏大小随着海拔升高也减小，这与小型哺乳动物的模式相似，可能是肾脏对低温环境中水代谢水平下调的适应结果(Hammondetal.，2001)。此外，上述器官与心脏的大小在个体水平上显著正相关，提示海拔对心脏及这些功能相关器官存在关联选择，但这需要进一步的数量遗传学分析予以验证。

脾脏是脊椎动物体内最大的免疫器官，其质量是衡量动物免疫功能的一个重要形态指标(Nelson &Demas，1996；金晨晨等，2014；张志强，2015)。本研究发现，中华蟾蜍的脾脏质量随海拔增加没有变化，这与我们对其天然免疫能力沿海拔变化的模式并不一致(未发表数据)。值得注意的是，脾脏和肺脏质量存在显著的相关性，暗示二者在功能上的关联和整合。此外，雌性的各脏器普遍大于雄性，推测这与雌性繁殖能量代价相关，但这与野外其他两栖类的发现并不一致(Garofaloetal.，2006；Jonssonetal.，2009)。这可能与逆梯度选择的性别差异有关，但需进一步研究验证。此外，与肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等实质脏器相比，心脏大小没有随驯化时间发生变化，暗示与其他内脏器官相比，心脏的表型弹性最小。最后，样线间的差异暗示这2条水系中的中华蟾蜍可能经历了不同的环境选择压力。