巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌的生长预测模型构建

孟司奇，丁高蓝，肖兴宁，肖英平，杨 华，汪 雯

(浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室(筹)，浙江 杭州 310021)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是革兰氏阳性菌，广泛分布于牛奶、肉类、蛋类等食物中，是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一[1]。据统计，2018年，上海市生鲜肉中金黄色葡萄球菌的检出率为32.9%[2]；我国生牛乳中金黄色葡萄球菌的检出率则为15%～38%[3]。对我国2003—2015年学校食源性疾病发生趋势的分析表明，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒人数排名前5，对公共卫生安全构成了较大威胁[4]。金黄色葡萄球菌肠毒素是一种细菌外毒素，对高温、低pH环境具有较强耐受性，危害性更大。据统计，有50%～75%的金黄色葡萄球菌在合适的条件下能产生肠毒素[5-6]。美国疾病控制与预防中心(CDC)报告显示，金黄色葡萄球菌肠毒素已成为世界性的食品安全问题[7]。

巴氏杀菌乳是生乳在低于100 ℃的温度下处理适当时间杀死部分致病菌制得的液态乳，与超高温灭菌乳相比，巴氏杀菌后乳品中的营养价值保存较好。这是巴氏杀菌乳在国外乳品市场占有率高的原因之一[8-9]。乳制品在原料收集、加工、储藏的过程中往往会受到金黄色葡萄球菌的污染[10]，但是巴氏杀菌的工艺特点决定其并不能杀灭所有微生物，如果储藏温度适合，巴氏杀菌乳将成为金黄色葡萄球菌生长的良好培养基[11]。据2017年对我国市售巴氏杀菌乳微生物污染的调查，散装巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌检出率为2.65%[12]。研究表明，当巴氏杀菌乳中的金黄色葡萄球菌含量达到105～107CFU·mL-1，即可产生足量的肠毒素造成人体中毒[13]。因此，研究金黄色葡萄球菌在巴氏杀菌乳中的生长情况对于保障乳品，乃至食品安全来说都具有积极意义。

预测微生物学利用数学模型定量分析食品中病原菌和腐败菌的生长和存活状况，评价环境因子对食品质量安全的影响，从而对货架期做出合理预测，旨在提高卫生检验效率，保障食品安全[14-15]。本实验以巴氏杀菌乳为原料，分别测定在4、10、16、20、24、28 ℃储藏条件下金黄色葡萄球菌含量的变化，分别采用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型构建恒定温度下巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌的生长动力学一级模型，另建立二级模型以描述温度与最大生长速率(μmax)的关系，并通过外部验证方法检验预测模型的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：金黄色葡萄球菌菌株(ATCC 25923)；市售巴氏杀菌乳。

试剂：Baird-Parker琼脂培养基、卵黄亚碲酸钾增菌剂，北京路桥技术股份有限公司；脑心浸出液(BHI)、缓冲蛋白胨水(BPW)，美国BD公司；NaCl(分析纯)，广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

KB240恒温恒湿培养箱，德国Binder公司；SPX-150B-Z生化培养箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；HVA-85高压蒸汽灭菌锅，日本Hirayama株式会社；WB04XL螺旋涂布仪，英国Don Whitley Scientific公司；ProtoCOL P3/1513 菌落计数仪，英国Synbiosis公司；1300 series A2生物安全柜，美国Thermo公司。

1.3 恒定温度下金黄色葡萄球菌的生长曲线测定

1.3.1 菌液制备

取超低温保存的金黄色葡萄球菌菌株，常温化冻，使用移液枪吸取0.1 mL添加到5 mL含7%(质量分数)NaCl的BHI中，37 ℃培养24 h进行菌株复苏。将复苏后的菌株充分摇匀，得到菌含量约为108CFU·mL-1的菌悬液，用BPW稀释到105CFU·mL-1备用。

1.3.2 金黄色葡萄球菌的接种、培养和计数

在巴氏杀菌乳中添加菌悬液，制备菌含量约为103CFU·mL-1的初始污染试样。将试样充分摇匀后，分别放置在4、10、16、20、24、28 ℃培养箱中培养，根据不同温度下的生长速率设定相应的取样时间，将取出的样品用BPW进行适当稀释，利用螺旋涂布仪进行平板涂布，放置恒温培养箱中培养24 h，然后用平板计数仪对菌量进行计数。

1.3.3 一级模型拟合

一级模型主要描述微生物数量与时间的关系。本研究利用OriginPro 9.0软件，分别采用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型进行巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌在恒定温度下的生长曲线拟合[16-19]，建立特定温度下金黄色葡萄球菌随时间变化的一级生长模型，获得相对最大生长速率(μmax)。

Modified Gompertz模型方程为

(1)

Huang模型方程为

lgNt=lgN0+lgNmax-lg{exp(lgN0)+[exp(lgNmax)-exp(lgN0)]*exp[-μmax*(B)]}，

(2)

(3)

式(1)～(3)中：Nt为t时刻的菌落数(CFU·mL-1)，N0为初始菌落数(CFU·mL-1)，Nmax为最大菌落数(CFU·mL-1)，μmax为相对最大生长速率(h-1)，λ为菌生长迟滞期(h)。

Logistic模型方程为

(4)

式(4)中：t0为细菌生长速率最大时所对应的时间(h)，p为t0时的相对生长速率(斜率，h-1)。

Baranyi模型方程为

(5)

(6)

式(6)中h0为微生物初始生理状态。

1.3.4 二级模型拟合

引入二级模型描述温度对初级模型参数的影响。本研究采用平方根模型和Arrhenius模型拟合温度-相对最大生长速率(μmax)曲线[20-21]。

平方根模型方程为

(7)

式(7)中：b为系数；T为培养温度(℃)；Tmin为最低生长温度(℃)，指微生物没有代谢活动时的温度，是通过外推回归线与温度轴相交而得到的温度。

Arrhenius模型方程为

(8)

式(8)中：a为频率因子；T为温度(℃)；R为气体常数，8.314 J·mol-1·℃-1；ΔG′为吉布斯自由能(J·mol-1)；n为指数系数。

1.3.5 模型的评价和验证

利用决定系数(R2)、均方根误差(RMSE)和赤池信息准则数值(AIC，衡量统计模型拟合优良性的一种标准，值越小越好)评价一级模型的拟合程度；利用R2、RMSE评价二级模型，并采用准确因子(Af)和偏差因子(Bf)验证准确度。

Af和Bf是验证模型可靠度的有效工具[22]。Af可以衡量预测值和观测值的接近程度。一般认为，Af值越接近于1，表明模型平均精确度越高，Af值介于1.1～1.9的模型也可接受[23-24]。Bf可以衡量预测值的偏离程度。一般认为，Bf值越接近于1越可靠，在0.90～1.05的表现良好，在0.70～0.90或1.05～1.15的也可接受[25-26]。本研究采用ComBase模型[27]和文献[28-32]中金黄色葡萄球菌在巴氏杀菌乳或生鲜乳等原料中的生长数据进行外部验证，计算Af和Bf。

(9)

(10)

式(9)、(10)中：pre为预测值，obs为实测值，n为测量值个数。

2 结果与分析

2.1 一级模型建立

结合实验结果和图1可知，4 ℃下巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌菌落数的对数值在0～216 h下降了0.2个单位[lg(CFU·mL-1)]，金黄色葡萄球菌处于缓慢失活的过程。采用OriginPro 9.0软件，分别利用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型对10、16、20、24、28 ℃下巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌的生长数据进行拟合(图2)，并由此得到相应的模型参数(表1～4)。由表1可知，各温度下巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌菌落数的对数值均随时间推进而呈上升趋势，并且随着温度升高，相对最大生长速率(μmax)不断升高，迟滞期(λ)不断下降，说明金黄色葡萄球菌的生长状况与温度密切相关。

图1 巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌在4 ℃的衰亡趋势Fig.1 Survival trend of S. aureus in pasteurized milk at 4 ℃

由表1～4可知，10～28 ℃下4种模型的决定系数(R2)均大于0.97；Huang模型与其他3种模型相比，AIC值较高，且在16 ℃下R2较低(0.97)；Logistic模型的p值与Baranyi模型的μmax值均在16 ℃最高，然后随温度升高呈下降趋势，与实际情况不符，只有Modified Gompertz模型的μmax值与温度呈正相关关系。综上，本研究选用Modified Gompertz模型为最终的一级模型。

表1 Modified Gompertz模型拟合得到的生长参数和拟合参数

2.2 二级模型建立

一级模型主要描述微生物数量与时间的定量关系，无法表达环境因素对微生物生长的影响。本研究主要考虑温度对生长参数的作用，利用平方根模型和Arrhenius模型作为二级模型，根据Modified Gompertz模型拟合得到的巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌在不同温度下生长的μmax，采用OriginPro 9.0软件对温度与μmax的关系进行拟合(图3)。

表2 Huang模型拟合得到的生长参数和拟合参数

表3 Logistic模型拟合得到的生长参数和拟合参数

表4 Baranyi模型拟合得到的生长参数和拟合参数

由图3可见，Arrhenius模型的R2为0.99，而平方根模型的R2为0.90，说明Arrhenius模型的拟合度更高；因此Arrhenius模型较平方根模型能更好地描述本研究中10～28 ℃范围内巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌相对最大生长速率与温度的关系。

图3 Arrhenius模型(A)和平方根模型(B)拟合的μmax与生长温度的关系曲线Fig.3 Fitted relationship of maximum growth rates of S .aureus with temperatures by Arrhenius model (A) and square root model (B)，respectively

2.3 模型评价与验证

预测模型构建后，不仅要对其拟合度进行评估，还要在应用之前经过验证来对模型的可靠性做出评价。本研究利用外部验证对建立的二级模型进行验证。

由表5可知，相较于平方根模型，Arrhenius模型的R2(0.99)更高，RMSE值(0.60)更低，说明Arrhenius模型的拟合程度高，离散程度低。Arrhenius模型的Af值为1.39，Bf值为0.87；平方根模型的Af值为1.57，Bf值为0.83。两种模型的Af值和Bf值均在合理范围内，但前者更接近于1。综上，Arrhenius模型的预测效果更好。

表5 二级模型的Af、Bf、RMSE和R2

在本研究检索范围内，关于巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌生长预测模型的文献研究较少，所以本研究结合了金黄色葡萄球菌在生鲜乳、灭菌乳等产品中的实验数据进行模型的外部验证，不同来源的数据偏差较大，致使Af值偏大，但也体现了模型的普适性。

3 讨论

预测微生物学通过数学模型对特定环境下微生物的数量变化进行预测。目前，已有许多学者就乳品中微生物的预测模型进行了研究。魏钊异等[33]利用Ratkowsky平方根模型描述了温度对巴氏杀菌乳中微生物菌群生长的影响，所建模型能有效预测菌落总数的动态变化；赵鑫等[34]将神经网络模型与Gompertz模型相比较，建立了以温度为自变量的平方根模型；Fujikawa等[35]构建了14.0～36.5 ℃下金黄色葡萄球菌在灭菌乳中的生长模型和产肠毒素模型，认为肠毒素产生速率与温度呈线性关系，为控制灭菌乳中的金黄色葡萄球菌及其肠毒素供了科学数据，但因为巴氏杀菌乳独特的工艺，导致基于灭菌乳建立的模型在巴氏杀菌乳中适用性并不高。本文描述了巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌的生长动态规律，可以为巴氏杀菌乳的定量风险评估提供帮助。

现有的定量风险评估通常使用105CFU·mL-1的金黄色葡萄球菌作为产生足量肠毒素并导致食物中毒的阈值[36]。当巴氏杀菌乳中的金黄色葡萄球菌的初始含量为103CFU·mL-1时，在10 ℃下约需130 h其含量即可达到105CFU·mL-1，在16 ℃下这一过程约需28 h，而在20、24、28 ℃下则仅需17～19 h。所以，当储藏温度为28 ℃时，虽然20 h以内巴氏杀菌乳的感官品质不会发生明显变化，但是却会给人体健康埋下较大隐患。因此，在巴氏杀菌乳的运输、销售和存储过程中，均应严格控制存放温度和时间。

多项研究报道，金黄色葡萄球菌肠毒素的产生除了受金黄色葡萄球菌浓度的影响外，还受到外部环境和自身的综合影响。这就导致学界一直以来都未能建立准确的剂量-反应模型。因此，目前基于金黄色葡萄球菌数量进行的安全性评价仍具有一定的局限性[37-38]。未来，可在巴氏杀菌乳中结合更多环境因素的影响建立金黄色葡萄球菌和肠毒素预测模型，确立二者的定量关系，为巴氏杀菌乳的风险评估提供全面、高效的信息。

综上，本文研究了4～28 ℃范围内金黄色葡萄球菌在巴氏杀菌乳中的生长规律，建立了巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌生长的一级模型和二级模型。综合比较了4种一级模型的效果，发现Modified Gompertz模型在不同温度下拟合度均较好，是描述巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌生长规律的最适一级模型。对比平方根模型，Arrhenius模型的R2和RMSE值分别为0.99和0.60，可作为二级模型拟合相对最大生长速率与温度间的关系。外部验证结果表明，Af值和Bf值均在可接受范围内，说明本实验所建立的二级模型能够较准确地预测巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌的生长状况，模型具有可靠性。本研究可为巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌的安全性评价、乳品货架安全期预测，以及乳品乃至食品中致病微生物的定量研究提供依据。