锰离子胁迫下外生菌根真菌对土壤钾释放的影响

张 亮，李玉婷，许晓风，2，*

(1.南京师范大学泰州学院 化学与生物工程学院，江苏 泰州 225300； 2.南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京 210023)

锰元素广泛分布于矿石和硅酸盐岩石中。土壤中锰含量在10～9 478 mg·kg-1变化，我国土壤锰含量总体表现为南高北低[1]。目前，南方部分地区受酸雨影响，土壤中铝、锰大量溶出，加上电子工业、机械制造等产业排放，以及一些锰矿和有色金属矿的粗放式开采，土壤锰污染非常严重[2]。微量的锰元素可以促进植物生长，但是土壤中过量的锰元素将会抑制植物的生长，同时阻碍植物对其他矿质元素，如磷、钾、镁等的吸收[3-4]。在我国南方的一些森林植被系统，山高坡陡，土壤贫瘠，加上土壤酸化，给本来就很脆弱的森林生态系统带来了更多的不稳定性，大面积的森林植被退化。对锰污染土壤的治理和修复已刻不容缓。

在锰污染土壤上植树造林是有效的治理途径之一。在森林土壤中，多种树木的根系可以与外生菌根真菌形成共生体，既能提高植物对重金属锰的拮抗能力，同时有助于植物根系对土壤矿质养分的吸收，从而有效缓解森林植被退化[5-6]。植物-真菌共生体具有活化土壤难溶性磷、钾和拮抗重金属的能力，一般认为，主要是共生真菌在植物根系表面形成的菌丝套和外延菌丝在起作用[7-8]。有研究表明，在受到重金属污染的矿区，外生菌根真菌菌丝中的相应重金属含量也会很高，但这些菌株却能一直生存下去，并表现出极高的侵染能力，这说明外生菌根真菌能够缓解重金属的危害[9-10]。一方面，外生菌根真菌与植物形成共生体之后，会产生菌丝套，从而减少或避免锰离子的危害[11]；另一方面，外生菌根真菌能够产生多种有机酸，包括草酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乳酸等，特别是草酸能与锰离子结合成稳定的络合物，限制锰离子通过细胞膜进入细胞[12-13]。此外，这些有机酸还能够直接作用于云母、钾长石、花岗岩等含钾矿物，使钾离子溶出，供森林树木吸收利用[14-15]。目前，涉及外生菌根真菌的研究多关注于菌根化苗木的培育方面，关于锰离子污染胁迫环境下外生菌根真菌活化土壤难溶性矿质元素的研究在检索范围内还未见报道。本研究选取南方森林酸性黄红壤作为供试土壤，研究外生菌根真菌在锰离子胁迫下活化土壤难溶性钾的能力及其作用机制，以期为锰污染土壤的治理和森林植被的恢复提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

试验选择彩色豆马勃(Pisolithustinctorius，Pt)和松乳菇(Lactariusdeliciosus，Ld)2种外生菌根真菌作为供试菌种，将2株供试菌种接种到去除钾源的Pachlewsk固体培养基(磷酸二氢钠代替磷酸二氢钾)[16]中，活化14 d备用。

1.1.2 土壤

供试土壤系采自浙江安吉藏龙百瀑景区马尾松林下的底层土壤，属发育于砂岩的酸性黄红壤。将土壤自然风干后，去除石子、杂草等，过筛(100目)，称取1.000 g土壤装入两端用玻璃纤维和滤膜(孔径0.22 μm)封口的PVC管(直径1 cm、长度2 cm)中，高压蒸汽灭菌(121 ℃，30 min)后备用。土壤理化性质如下：有机质20.5 g·kg-1，全氮1.07 g·kg-1，全钾9.55 g·kg-1，pH值4.25，有效钾82.2 mg·kg-1。

1.2 试验设计

我国南方锰矿区周围土壤溶液中锰离子含量介于157.1～824.5 mg·L-1[17]，因此，本试验配置锰离子质量浓度分别为0、100、200、400、800 mg·L-1的缺钾Pachlewsk液体培养基，将pH调至4.25。取20 mL的液体培养基装入三角瓶中，加入装有1.000 g土壤的PVC管一个，包扎封口，高压蒸汽灭菌(121 ℃，30 min)，在超净工作台中接种1块按1.1.1节描述活化好的固体菌块(直径为6 mm)，另以不接种真菌、锰离子质量浓度为0的处理作为对照(CK)。以上各处理均重复5次。接种后25 ℃培养14 d，备测相关指标。

1.3 测定指标与方法

培养14 d后，过滤培养液，收集滤液和菌丝，用PHSJ-4A型酸度计(上海精密仪器仪表有限公司)测定滤液pH。菌丝烘干(105 ℃)后称重，测定生物量。干菌丝经浓硫酸-过氧化氢湿法消煮后用火焰光度法测定钾含量[18]。取出PVC管中的土壤，自然风干，分别用蒸馏水、醋酸铵(1 mol·L-1)和沸硝酸(1 mol·L-1)提取土壤中的水溶性钾、交换性钾和缓效钾，在上述溶液提取后的土壤中加入氢氧化钠固体，置于马弗炉中熔融(450 ℃)，得到矿物结构钾，最后采用火焰光度法测定钾含量[19]。

采用1260型高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)测定滤液中草酸、苹果酸、乙酸和柠檬酸含量，标准品为色谱纯。色谱条件如下：Hi-Plex H有机酸分析柱(300 mm×7.7 mm，8 μm)，流动相为水(稀硫酸调节pH至2.5)，流速为0.6 mL·min-1，进样量为20 μL，柱温为60 ℃，紫外检测波长为210 nm。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2010进行基本计算和绘图，采用SPSS 19.0进行方差分析和皮尔逊(Pearson)相关性分析。

2 结果与分析

2.1 锰离子对外生菌根真菌生物量、钾含量和钾吸收量的影响

2.1.1 锰离子对菌丝生物量的影响

在锰离子质量浓度逐渐升高的过程中，2株外生菌根真菌的生物量逐渐减低(表1)，生长受到显著(P<0.05)抑制。其中，Pt在锰离子质量浓度为800 mg·L-1时的生物量较锰离子质量浓度为0时降低了45.50%，Ld在锰离子质量浓度为800 mg·L-1时的生物量较锰离子质量浓度为0时降低了56.28%。在相同质量浓度的锰离子胁迫下，Pt的生物量均大于Ld，说明锰离子对Pt生长的抑制作用要弱于Ld。

2.1.2 锰离子对菌丝中钾含量、钾吸收量的影响

由表1可知，在缺钾的培养基中，2株外生菌根真菌都能从土壤中吸收钾元素供自身生长需要。锰离子胁迫下，2株外生菌根真菌吸收钾的能力存在差异。当锰离子质量浓度逐渐升高时，2株外生菌根真菌的钾含量和钾吸收量均表现出先升后降的趋势，且均在锰离子质量浓度为200 mg·L-1时达到最大值。

表1 锰离子对外生菌根真菌生长和钾吸收的影响

2.2 液体培养基中pH变化

2株外生菌根真菌在培养14 d后，液体培养基的pH值均随锰离子质量浓度升高而显著(P<0.05)降低(图1)。当锰离子质量浓度为800 mg·L-1时，Pt和Ld所在液体培养基的pH值分别较CK下降1.23、1.19个单位。在相同质量浓度的锰离子胁迫下，2株外生菌根真菌的培养基pH值相差不大。

2.3 锰离子对外生菌根真菌释放有机酸的影响

如表2所示，相同锰离子质量浓度下，Pt的草酸、乙酸分泌量高于Ld。Pt的草酸、乙酸分泌量分别在锰离子质量浓度为200、400 mg·L-1时最高，Ld的草酸、乙酸分泌量分别在锰离子质量浓度为400、800 mg·L-1时最高。此外，在外生菌根真菌Ld处理的溶液中还检测到苹果酸和柠檬酸。

表2 液体培养基中真菌释放有机酸的质量浓度

2.4 锰离子胁迫下外生菌根真菌对土壤不同形态钾含量的影响

由表3可知，接种外生菌根真菌后土壤交换性钾、缓效钾和矿物结构钾较CK显著(P<0.05)变化，但在部分锰离子质量浓度条件下土壤中水溶性钾含量变化不显著。与CK相比，各锰离子质量浓度下土壤中难溶性的矿物结构钾含量均显著(P<0.05)降低，同时土壤中的交换性钾和缓效钾含量均显著(P<0.05)提高。当锰离子质量浓度为200 mg·L-1时，2株外生菌根真菌分解矿物结构钾的能力最强，分解率分别达到4.16%(Pt)和2.58%(Ld)，土壤中缓效钾含量增加最多，分别比CK增加了16.17%(Pt)和11.30%(Ld)。当锰离子质量浓度分别为400、800 mg·L-1时，接种Pt、Ld的土壤中交换性钾含量增加最多，分别比对照提高了20.34%和17.78%。以上结果说明，在锰离子胁迫下，外生菌根真菌能活化土壤中的难溶性钾用于补充缓效钾和交换性钾，菌株Pt分解土壤难溶性钾的能力强于Ld。

CK中不引入真菌菌株。同一菌株各柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。There was no strain in CK. Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05 for the same strain. The same as below.图1 真菌生长对液体培养基pH的影响Fig.1 Effects of fungus growth on pH of liquid culture medium

土壤中的水溶性钾和交换性钾合起来即为土壤有效钾。由表3可知，土壤有效钾含量因培养基中锰离子质量浓度和菌株不同而异。与CK相比，2株外生菌根真菌均能提高土壤有效钾含量，当锰离子质量浓度分别为400、800 mg·L-1时，接种Pt、Ld的土壤有效钾含量增加最多，分别增加了19.76%和17.23%。菌株Pt提高土壤钾有效性的能力强于Ld。

表3 土壤中不同形态钾素含量

2.5 各因素的相关分析

由表4可知：培养液中pH与土壤中交换性钾含量呈极显著(P<0.01)负相关，与土壤水溶性钾含量呈极显著(P<0.01)正相关；草酸含量与土壤交换性钾含量呈极显著(P<0.01)正相关，与缓效钾含量呈显著正相关(P<0.05)，与矿物结构钾含量呈显著(P<0.05)负相关。此外，土壤水溶性钾含量与交换性钾含量呈极显著(P<0.01)负相关，交换性钾含量与缓效钾含量呈显著(P<0.05)正相关，缓效钾含量与矿物结构钾含量呈极显著(P<0.01)负相关。以上结果说明，外生菌根真菌分泌的草酸和培养液中pH的降低有利于土壤中矿物结构钾的分解，分解的难溶性钾可以用来补充缓效钾和交换性钾。

表4 试验各因素的相关系数

3 结论与讨论

外生菌根真菌与树木根系形成共生体后，有益于植物抵抗不良环境[20]。在重金属影响下，真菌菌丝的生长情况能直接反映其抵御不良环境的能力[21-22]。在本研究中，2株外生菌根真菌对锰离子的敏感度不同，在相同质量浓度的锰离子下，Pt的菌丝生物量均大于Ld，说明Ld对锰离子比较敏感，抗性较差，而Pt对锰的抗性较强，在较高质量浓度的锰离子胁迫下也能很好地生长。研究表明，菌株Pt对其他金属，如铝、镉、汞等亦表现出较强的抗性[23-24]。在较低的锰离子质量浓度下(0～200 mg·L-1)，菌丝钾吸收量逐渐升高，但当锰离子质量浓度在400～800 mg·L-1时，外生菌根真菌菌丝中的钾含量逐渐降低。这说明低质量浓度的锰离子能促进外生菌根真菌从周围低钾的环境中吸收钾元素，然而当锰离子的质量浓度超过一定范围时，将不利于真菌从环境中吸收矿质元素。

土壤中的钾主要呈无机态，其中矿物结构钾占90%～98%，缓效钾约占2%，有效钾仅有1%～2%(包括水溶性钾和交换性钾)。土壤中的多种微生物能活化利用钾长石、云母、伊利石中的钾元素[25-26]。本研究发现，在锰离子胁迫下，接种的外生菌根真菌可以分解土壤中的矿物结构钾，但不同菌株的分解能力存在差异。当锰离子质量浓度为200 mg·L-1时，2株外生菌根真菌分解矿物结构钾的能力最强，分解率分别达到了4.16%(Pt)和2.58%(Ld)。同时，2株外生菌根真菌都能增加土壤中的缓效钾和交换性钾。这说明，在锰离子胁迫下，外生菌根真菌能活化土壤中的难溶性钾，分解的难溶性钾可用于补充缓效钾和交换性钾。

外生菌根真菌侵染植物后，可以促使宿主植物根系向土壤中释放氢离子，进入2∶1型非膨胀性含钾矿物晶层中，替换其中的钾离子，从而提高钾元素的有效性，满足植物对矿质元素的需求[27-28]。本研究发现，培养基中的pH随着锰离子质量浓度升高而逐渐下降，其中菌株Pt在锰离子质量浓度为800 mg·L-1时下降最多，与CK相比下降1.23个单位(即其培养基中的氢离子浓度是对照组的17倍)，而且培养液中pH与土壤中交换性钾含量呈极显著负相关，说明外生菌根菌可以通过氢离子的分泌，从土壤矿物中获得钾离子，并提高土壤有效钾的含量。外生菌根真菌在低钾的环境中，能向周围分泌草酸、甲酸、柠檬酸和丁二酸等有机酸，其中以草酸分泌量最大[29]。在体外纯培养条件下，外生菌根真菌活化铁矿石中的磷、钾元素主要依靠菌丝产生的有机酸，菌丝与矿物的物理接触可能在铁矿石的风化过程中也起到关键的作用[30]。利用草酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸对黑云母、白云母和微斜长石进行溶钾能力研究，结果发现，草酸提取矿石中钾的能力最强[31]。草酸对难溶性矿物中的钙、铝、铁等金属有较强的络合能力，同时又能电离出氢离子，通过酸解作用活化矿物中的钾元素[32]。本研究发现，菌株Pt能分泌草酸和乙酸，Ld能分泌草酸、乙酸、苹果酸和柠檬酸，其中草酸分泌量最高(Pt为95.26 mg·L-1，Ld为72.14 mg·L-1)。相关性分析结果显示，培养液中的草酸分泌量与土壤交换性钾、缓效钾含量呈显著正相关，与土壤矿物结构钾含量呈显著负相关，土壤缓效钾与矿物结构钾含量呈极显著负相关。笔者推测，外生菌根真菌分泌的草酸在活化土壤矿物结构钾的过程中起到关键作用。草酸分泌能力的差异，可能是导致2株外生菌根真菌活化土壤难溶性钾的能力不同的原因之一。

在我国南方大部分地区，土壤中锰离子的有效性受酸雨影响逐渐提高，加上森林土壤矿质营养贫瘠，导致树木根系周围有益微生物生长受限，进而影响到根系对磷、钾、钙、镁等矿质元素的吸收。本研究中，菌株Pt和Ld对锰的抗性强弱有差异，同时，二者活化土壤难溶性钾的能力也存在差异，研究结果可为筛选合适的菌株来侵染苗木进行造林提供科学参考。