长链非编码RNA HAND2-AS1对口腔鳞状细胞癌增殖和糖代谢的影响

刘德裕 翦新春，2 徐普 朱蓉 王友元

1中南大学湘雅医学院附属海口医院口腔颌面外科（海口570208）；2中南大学湘雅医学院附属湘雅医院口腔颌面外科（长沙410008）；3中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科（广州510120）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常见的头颈部恶性肿瘤，在全身癌症中发病率列第8 位［1］。尽管手术治疗与放化疗技术在不断发展，但OSCC 患者的总体生存率没有显著提高［2］。因此，寻找一些新的关键基因或标志物将有助于OSCC 的早期诊断，靶向治疗以及改善患者预后［3］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是长度＞200 nt的一类非编码RNA，lncRNA 在转录起始的调控、转录及转录后的调控中均发挥着重要作用，因而影响着各种生物学过程［4-5］。越来越多的研究表明，lncRNA 在各类肿瘤，如食管鳞癌［4］、前列腺癌［6］、胰腺癌［7］中异常表达，与肿瘤的早期诊断、靶向治疗、预后等密切相关。HAND2-AS1（heart and neural crest derivatives expressed 2-antisense RNA 1）是一条新发现的定位于人类第6号染色体上的lncRNA，它在肿瘤中尤其是OSCC 中的表达及功能仍不清楚。代谢重编程是肿瘤的重要特征，肿瘤细胞会比正常细胞消耗更多的葡萄糖，且肿瘤细胞糖酵解的速率远高于氧化磷酸化，这一现象被称为Warburg 效应［8］。目前研究证实lncRNA 在肿瘤代谢过程中发挥着关键的调节作用，参与包括葡萄糖、脂质和谷氨酰胺代谢等多种代谢途径［9］。本研究旨在检测HAND2-AS1 在OSCC 及细胞系中的表达水平，通过构建稳定表达HAND2-AS1 的细胞株，观察HAND2-AS1 对口腔癌细胞增殖和糖代谢的影响，进而探究HAND2-AS1 可能发挥作用的机制，为临床诊疗提供一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本及细胞系收集中南大学湘雅医学院附属湘雅医院和附属海口医院口腔颌面外科2012年5月至2014年12月手术切除的OSCC 及其癌旁组织共52 例，所有样本均经病理学诊断证实。所有患者均已被告知并签署由本院伦理委员会批准的知情同意书。口腔癌细胞系Cal27、SCC9和SCC25 购自ATCC 细胞库，HSC3 和HOK 细胞购自赛库生物公司（广州）。

1.1.2 试剂DMEM 及DMEM/F12 培养基（Gibco公司，美国）；TRIzol 和Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；PrimeScriptTMRT reagent Kit 和SYBR Green PCR Master Mix（TAKARA公司，日本）；CCK-8试剂（上海翌圣生物科技公司）；葡萄糖测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）；乳酸测定试剂盒（南京建成生物有限公司）；抗GLUT1 抗体（12939）（CST 公司，美国），抗β-actin 抗体（60008-1-Ig）（Proteintech 公司，武汉）。HAND2-AS1过表达慢病毒质粒（上海汉恒生物公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养Cal27、HSC3 和HOK 细胞以含10% FBS 的DMEM 培养基培养，SCC9 和SCC25 细胞用含15% FBS 的DMEM/F12 培养基培养。放置于37 ℃，5% CO2的培养箱中，取生长对数期细胞进行实验。

1.2.2 RNA提取及qRT-PCRTRIzol法提取OSCC组织及细胞中的总RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit 反转为相应的cDNA。按照SYBR Green PCR Master Mix 的说明书，以cDNA 为模板进行qRTPCR 检测，以β-actin 为内参采用2-ΔΔCt法进行相对表达量的计算。HAND2-AS1 上游引物序列为GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC，HAND2-AS1 下游引物序列为CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG，由上海捷瑞公司合成。

1.2.3 细胞转染取293T 细胞铺板，至细胞融合至80%～90%时加入适量Lipofectamine 2000 的试剂转染HAND2-AS1 过表达质粒和PSPAX2，PMD2G包装质粒，72 h 后收集病毒液，0.45 μm 滤器过滤。向口腔癌细胞加入含Lv-HAND2-AS1 和Lv-NC 病毒液，转染24 h 后更换新鲜培养基，72 h 后嘌呤霉素筛选5 d。

1.2.4 CCK-8 实验将转染后的SCC9 和Cal27 细胞（2 000 个/孔）接种于96 孔板，放于37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。在不同时间点（0、1、2、3、4 d）每孔分别加入含10 μL CCK-8 的培养基，37℃避光孵育4 h，利用酶标仪450 nm 检测相应OD值，并绘制生长曲线。

1.2.5 平板克隆实验将转染后的OSCC 细胞（1 000 个/孔）种到六孔板内，培养7 d 后，加4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色3 min，拍照并计数。

1.2.6 葡萄糖摄取和乳酸分泌检测收集OSCC细胞培养液，离心后取上清液，设置空白和标准对照，按照使用葡萄糖测定试剂盒及乳酸测定试剂盒的使用方法，采用酶比色法检测反应终产物吸光度值，即葡萄糖及乳酸的相对含量。

1.2.7 蛋白质印迹法RIPA 裂解液裂解细胞，离心收集上清，加入5×loading buffer，100 ℃煮5 min。准备10%SDS-PAGE 胶，取适量样品上样。80 V 恒压30 min，120 V 恒压1 h，进行转膜1 h。5%脱脂奶粉封闭1 h 后一抗4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次后，孵育对应二抗1 h。TBST 洗膜3 次后，加入ECL 发光液进行曝光。

1.3 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0 软件进行分析，计量资料采用（）表示，两组之间的比较采用Studentt检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HAND2-AS1 在OSCC 组织及细胞系内的表达qRT-PCR 检测52 例OSCC 及其癌旁样本中HAND2-AS1 的表达水平，结果显示发现HAND2-AS1 在OSCC 的表达量与癌旁组织相比显著降低（P＜0.01，图1A）；在T3-4 期OSCC 组织内HAND2-AS1 的表达较T1-2 期组低（P＜0.05，图1B）；无淋巴结转移组的HAND2-AS1 的表达较发生淋巴结转移组更高（P＜0.01，图1C）。此外，HAND2-AS1在各个口腔癌细胞株中的表达均显著低于正常口腔上皮细胞HOK 中的表达，其中SCC9 和Cal27 细胞表达最低（图1D）。

图1 HAND2-AS1 在OSCC 组织及细胞中的表达水平Fig.1 The expression of HAND2-AS1 in OSCC tissues and cell lines

2.2 过表达HAND2-AS1抑制OSCC细胞增殖笔者将空白对照组命为Lv-NC 组，HAND2-AS1 过表达 组 命 为Lv-HAND2-AS1 组，qRT-PCR 证 实HAND2-AS1 的表达在Lv-HAND2-AS1 组口腔癌细胞中显著升高（P＜0.01，图2A、B）。CCK-8 实验检测Lv-HAND2-AS1 组和Lv-NC 组OSCC 细胞的增殖能力，结果显示上调HAND2-AS1 明显抑制了Cal27和SCC9 细胞的增殖能力（P＜0.01，图2C、D）。此外，也用平板克隆形成实验验证了过表达HAND2-AS1 对OSCC 细胞增殖的影响，结果显示过表达HAND2-AS1 显著抑制了Cal27 及SCC9 细胞的平板克隆形成能力（P＜0.05，图2E、F）。

2.3 过表达HAND2-AS1 抑制OSCC 细胞葡萄糖摄取和乳酸分泌研究发现过表达HAND2-AS1可显著降低Cal27 和SCC9 细胞的葡萄糖摄取能力（P＜0.05，图3A）。此外，本研究亦使用乳酸测定试剂盒检测了乳酸相对产量的变化。如图3B 所示，过表达HAND2-AS1 明显减少了Cal27 和SCC9细胞的乳酸相对产量。

2.4 过表达HAND2-AS1抑制OSCC细胞中GLUT1的表达qRT-PCR 和Western Blot 结果显示，过表达HAND2-AS1 能显著下调Cal27 细胞和SCC9 细胞中GLUT1 的mRNA 和蛋白表达水平（图4A、B）。相对于癌旁组织，GLUT1 在OSCC 组织中表达更高（P＜0.05，图4C）。此外，Spearman相关性分析发现OSCC 组织中HAND2-AS1 的表达量与GLUT1 的表达量呈负相关（r=-0.6767，P＜0.01，图4D）。

3 讨论

近年来，lncRNA在肿瘤发生发展过程中的调控作用引起科学家的热切关注，lncRNA可以与蛋白或者核酸形成复合物参与染色质重塑、转录及转录后调控等多种生物学过程［10-11］。有研究表明lncRNA可发挥肿瘤促进或抑制因子的作用影响OSCC 的生物学行为，如：与癌旁组织相比，ADAMTS9-AS2在口腔癌组织中高表达，与OSCC患者的预后密切相关，它通过miR-600/EZH2 轴促进OSCC EMT 及转移［12］。过度表达的CILA1激活了Wnt/β-catenin通路，促进OSCC耐药性的形成［13］。相比之下，MEG3在OSCC组织中显著低表达，它在OSCC 中发挥抑癌作用抑制细胞增殖［14］。HAND2-AS1 是一种新发现的lncRNA，其在OSCC中的表达和作用机制仍不清楚。

图2 过表达HAND2-AS1 对OSCC 细胞增殖及克隆形成能力的影响Fig.2 HAND2-AS1 over expression inhibits OSCC proliferation and colony formation

图3 过表达HAND2-AS1 对于OSCC 细胞糖代谢的影响Fig.3 HAND2-AS1 overexpressioninhibits glucose metabolism in OSCC

本研究检测了52 对OSCC 及其癌旁组织中HAND2-AS1 的表达水平。结果发现相较于癌旁组织，HAND2-AS1 在OSCC 组织的表达水平显著低于癌旁正常组织，且HAND2-AS1 在多种OSCC 细胞的表达水平明显低于永生化的正常口腔上皮细胞HOK。同时，与T1-2 期癌组织相比，HAND2-AS1 在T3-4 期OSCC组织内的表达水平更低，这提示HAND2-AS1 的表达与OSCC 的发展过程相关。此外，发生远处淋巴转移的OSCC 患者HAND2-AS1 表达更低，其低表达能显著增加淋巴结转移的风险。以上结果提示HAND2-AS1 是参与OSCC发生发展过程的重要因子。最近有研究报道HAND2-AS1 在肝癌干细胞中高表达，它募集INO80 蛋白到BMPR1A 的启动子区并诱导其表达继而激活BMP 通路，促进肝癌干细胞的自我更新并驱动肝癌发生［15］。笔者在本研究中采用CCK-8和克隆形成实验证实了HAND2-AS1 过表达能抑制OSCC 细胞增殖，这些结果说明与肝癌不同的是HAND2-AS1 在OSCC 中作为抑癌基因发挥作用。

图4 过表达HAND2-AS1 对OSCC 中GLUT1 表达的影响Fig.4 HAND2-AS1 overexpression inhibits GLUT1 expression in OSCC

Warburg 效应是重要的肿瘤生物学行为，它普遍存在于不同类型的肿瘤细胞中，肿瘤恶变过程中涉及葡萄糖过量摄取、乳酸累积等代谢过程，为肿瘤细胞在恶劣的微环境中生存并无限增殖提供了充足的物质和能量基础［16-17］。近年来lncRNA 与肿瘤Warburg 效应的关系成为研究的热点，有研究报道lncRNA 可与miRNA 相互作用进而影响肿瘤的代谢过程［18］。LincRNA-p21 通过稳定HIF-1α的表达增强前列腺癌细胞糖酵解功能，同时HIF-1α增强了编码糖酵解酶GLUT1 的表达［19］。此外，lncRNA XIST 在胶质母细胞瘤内发挥分子海绵的作用吸附miR-126，继而激活IRS1/PI3K/Akt 通路增强葡萄糖代谢能力，最终促进胶质瘤细胞迁移、侵袭和抗凋亡能力［20］。LINC00504 通过ceRNA 机制与miR-1224 相互作用上调糖酵解关键酶PKM2，HK2 和PDK1 促进卵巢癌增殖和抗凋亡能力［21］。GLUT1 是位于细胞膜上的能够将葡萄糖转移至胞内的蛋白转运体之一，其表达在多种肿瘤细胞内显著上调［8，22-24］。笔者在实验中发现HAND2-AS1过表达抑制了口腔癌的葡萄糖摄取和乳酸排泄能力，进一步研究发现了HAND2-AS1 抑制了糖酵解酶关键酶GLUT1 的表达，且HAND2-AS1 与GLUT1的表达水平在口腔鳞癌组织中呈负相关。由此，笔者推测HAND2-AS1 低表达促进了GLUT1 介导的有氧糖酵解过程，继而促进口腔癌细胞增殖。但是HAND2-AS1是如何调控GLUT1表达的尚未明确。WANG 等［25］发现口腔癌中高表达的lnc-p23154通过吸附miR-378a-3p，上调糖代谢关键限速酶GLUT1 促进肿瘤有氧糖酵解，继而增强口腔癌侵袭和转移的能力。SHANG 等［26］发现SLC2A1-AS1与转录因子STAT3 竞争性结合使肝癌细胞中的FOXM1/GLUT1 轴失活，抑制有氧糖酵解。HAND2-AS1 可能不仅通过miRNA，还通过其他多个途径调控GLUT1 的表达，笔者将在后续研究中进一步进行验证。

本研究尚存在其他局限性，如所有研究结果只是通过口腔癌细胞验证，并未经过动物模型的验证。综上所述，低表达的lncRNA HAND2-AS1 通过抑制GLUT1 表达，抑制OSCC 细胞的增殖和有氧糖酵解能力，在OSCC 发生发展过程中可能扮演着抑癌基因的角色，对其深入研究有望成为OSCC 治疗的新靶点。