女贞子中黄酮类化合物的回流提取工艺研究

高亮亮，钱令芝，张 霞

(安徽科技学院，安徽 凤阳 233100)

女贞子(Ligustrilucidum)，别名白蜡树、桢木、将军树、冬青，是木犀科女贞属常绿灌木或乔木的果实。其外观是椭圆形或肾形，成熟后表皮呈紫黑色，主要分布于中国长江流域及南方各地，安徽等地也有大量种植[1]。在古医书中，将女贞子称作冬青，是在女贞子冬季成熟之后采摘，与其它药材配伍使用作为一剂治疗少白头，补肝肾的药材使用。

黄酮类化合物是女贞子的主要成分，具有降血压、降血脂、保肝护肝、抗炎抗病毒等生理活性[2]，它是一种天然的抗氧化剂；同时，黄酮还具有抑制癌细胞增殖和降低肿瘤细胞的耐药性等作用[3-5]。

女贞树极易种植，对气候和土壤要求不严格，而且很耐低温，因此安徽省内有女贞树大量种植的适宜条件。目前国内对女贞子的研究虽然也有很多，但对安徽本地女贞子的研究还较少。植物的药物含量受地域气候的影响较大，而女贞子是安徽省内比较丰富的植物资源，因其树形茂密整齐，是常用的观赏树种，且具有很高的药用价值[6]。故本论文研究安徽省本地的女贞子中黄酮类成分的最佳提取工艺，为安徽省女贞子资源得到充分开发和生产提供切实可靠参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

女贞子药材(2018年11月采于安徽科技学院凤阳校区内)；芦丁标准品，乙醇，NaOH，NaNO2，Al(NO3)3等试剂均为分析纯，购于国药试剂有限公司。

1.2 试验仪器

ESJ182-4分析天平(佑科仪器)；XFB-400高速中药粉碎机(吉首市中州制药机械厂)；UV-5500 紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品溶液的制备 精密称取1 g女贞子粗粉置于250 mL圆底烧瓶中，按一定料液比加入一定体积百分浓度的乙醇溶液,根据试验条件水浴回流浸提完成后，抽滤，保存滤液作供试品溶液备用。

1.3.2 对照品溶液的配制 将芦丁标准品干燥至恒重，精密称取标准品10.7 mg于100 mL容量瓶中，加无水乙醇溶液使其完全溶解后，再用无水乙醇定容至刻度，充分摇匀，即得浓度为0.107 mg/mL的芦丁对照品溶液，备用。

1.3.3 女贞子黄酮类化合物提取率测定 黄酮的提取率(mg/g)=C×V×N×106/M。其中，C：稀释后供试品中黄酮的浓度(μg/mL)，V：乙醇溶剂的体积(mL)，N：提取液稀释倍数，M：女贞子粉末质量(g)。

1.3.4 单因素试验实验 以乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)、回流温度(60、70、80、90、95 ℃)、回流时间(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)四个因素的五个水平，来进行单因素试验[7]。

1.3.5 响应面法优化实验设计 在得出单因素实验最佳水平后，运用Design Expert 8.0.6软件来设计四因素三水平响应面实验。该响应面实验能够同时对影响女贞子中黄酮提取率的乙醇体积分数、提取时间、料液比、提取温度交叉影响作用进行考察[5]。探索这些综合因素对于女贞子黄酮成分提取率的影响的大小，同时通过软件分析建立起各因素影响提取率的数学模型。

2 结果与分析

2.1 绘制标准曲线

以纵坐标为吸光度A，横坐标为浓度C(μg/mL)绘制芦丁标准曲线[8]，结果见图1。

图1 芦丁的标准曲线

2.2 女贞子黄酮类化合物提取的单因素实验结果

精密称取1 g女贞子粗粉置于250 mL圆底烧瓶中，按料液比1∶30加入70%的乙醇溶液，用80 ℃水浴回流浸提1 h，抽滤，保存滤液作供试品溶液备用。

2.2.1 乙醇体积分数对于黄酮提取率的影响 在女贞子水浴回流提取黄酮类化合物的单因素试验中，当以乙醇的体积分数为自变量，控制其他实验条件保持不变。女贞子中黄酮类化合物的提取率随着自变量的增大，呈现先增大后减小，当自变量乙醇的体积分数值为70%时，因变量女贞子黄酮类化合物的提取率的值达到最大，为3.515 mg/g；当自变量的值超过70%后，提取率开始逐渐降低。因此,70%乙醇的体积分数提取女贞子中黄酮类化合物较为合适(图2)。

图2 乙醇体积分数对于女贞子中黄酮类化合物提取率的影响

2.2.2 料液比对于黄酮提取率的影响 在女贞子水浴回流提取黄酮类化合物的单因素试验中，以料液比为自变量，控制其它实验条件保持不变时。当自变量料液比达到1∶30时，女贞子中黄酮类化合物的提取率最大，为4.541 mg/g。因此,料液比1∶30提取女贞子中黄酮类化合物较为合适(图3)。

图3 料液比对于女贞子中黄酮类化合物提取率的影响

2.2.3 提取时间对于黄酮提取率的影响 当以提取时间为自变量，其它实验条件保持不变时，在0.5～1 h的回流提取时间范围内，女贞子中黄酮类化合物的提取率呈现增长的趋势；当达到1 h的回流提取时间时，女贞子中黄酮类化合物的提取率最大，为4.488 mg/g；因此,选择回流提取时间为1 h是提取女贞子中黄酮类化合物最佳提取时间(图4)。

图4 回流提取时间对于女贞子中黄酮类化合物提取率的影响

2.2.4 提取温度对于黄酮提取率的影响 以提取温度为自变量，控制其它实验条件保持不变。在60～80 ℃的水浴回流提取温度范围内，女贞子中黄酮类化合物的提取率逐渐增大；当达到80 ℃的回流提取温度时，女贞子中黄酮类化合物的提取率达到最大，为4.286 mg/g；因此,提取温度为80 ℃时是提取女贞子中黄酮类化合物最佳提取温度(图5)。

图5 提取温度对于女贞子中黄酮类化合物提取率的影响

2.3 响应面优化实验的结果

2.3.1 实验设计与结果 通过单因素实验的结果，选取乙醇浓度(A)、回流时间(B)、回流温度(C)、料液比(D)4个因素做Box-Behnken设计，同时以黄酮提取率作为响应值，试验因素水平及编码见表1。

表1 Box-Behnken 因素与水平的实验编码

表2 响应面分析法结果

采用Design Expert8.0.6软件进行多元拟合回归分析[9-10]，得到黄酮类化合物的提取率(Y)与乙醇浓度(A)、回流时间(B)、回流温度(C)、料液比(D)的二次多项回归方程：Y=53.66+2.40A+6.98B+1.93C+0.024D-0.044AB-3AC-4AD-0.027BC+0.091BD-3CD-0.013A2-1.49B2-3C2-0.01D2。最佳提取率的理论值为5.437 6 mg/g。

表3 女贞子中黄酮类化合物的提取回归方程系数的方差分析结果

由表3可知，model中F=3.23，P<0.001，说明本试验所采用的二次模型是极显著的；并且乙醇浓度与回流温度交互项对女贞子中的黄酮提取率有较显著的影响；决定系数R2的值为0.923 5，越接近1，实验误差越小，所以用该模型预测和分析实验的结果可靠。

2.3.2 四个因素的交互作用 女贞子中黄酮类化合物提取率的三维立体图如图6所示。

图6 四个因素交互作用对提取率影响的等高线及响应面

根据图6可知，对女贞子中黄酮类化合物提取率的影响程度由高到低分别为：回流时间B>回流温度C>料液比D>乙醇浓度A，对提取率影响的大小顺序为AC>BD>CD>AB，其中乙醇浓度与提取温度对于提取率影响较大(P=0.04<0.05)。

2.3.3 验证试验 由于该系统分析得到的实验条件过于精细，不方便实际实验及生产的测量，配制以及控制；所以为了使其易于具体的实验及生产操作，故将女贞子中黄酮类化合物的提取工艺的最优提取条件修正为溶剂比70%、料液比1∶32、水浴提取温度79 ℃，回流提取1.25 h，此时得到的最佳提取率为5.437 6 mg/g，与预测值5.437 6 mg/g几乎误差为零，因此实验结果可被实际操作使用，并应用于今后的实际生产中。

3 结论与讨论

本实验在单因素试验所得的最优黄酮提取条件的基础上，通过响应面分析法对女贞子中黄酮类化合物的提取工艺进行优化，并建立了单因素与响应值之间的数学模型，研究结果显示，在溶剂比70%、料液比1∶32、水浴提取温度79 ℃，提取时间1.25 h的条件下，得到最佳提取率为5.437 68 mg/g。同时经验证实验，提取率实际值与预测值相差较小，结果可靠。本实验采用的响应面法，避免了正交实验的各种缺点，使优化结果的数据更加精准可靠。为今后的大量生产和试验提供了可靠的数据支撑，为安徽省内女贞子的更好开发利用提供参考。