低温等离子体活性水在食品领域的应用进展

李嘉慧，成军虎,2,*，韩 忠,2

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640；2.华南理工大学现代食品工程研究中心，广东 广州 510006）

等离子体（Plasma）是气体在受到外界高能量作用时电离产生的一种物态，通常又被称为固、液、气之外的物质第四态[1]。根据等离子体的能量高低可分为高温等离子体和低温等离子体两大类[2]。低温等离子体的气体电离度一般小于1%，电离气体中的带电粒子处于高能状态，温度达到几千甚至上万摄氏度，而其中的离子和分子温度仅在人体温度左右，所以“低温”是相对于带电粒子温度而言的，整个体系在宏观上表现为常温[1,3]。低温等离子技术兼具了物理效应、化学效应和生物效应，具有效率高、能耗低、绿色无污染等特点[4]，近年来已被广泛应用于化学材料[5]、环境工程[6]、生物医学[7]和农业[8]等领域。在食品领域中，低温等离子体技术作为一种新型的非热加工方式而备受瞩目，在食品微生物、包装材料处理和食品成分的功能性改性等方面都有较好的应用[9]。

低温等离子体活性水（PAW）是用低温等离子体处理不同性质水（如去离子水、磷酸盐缓冲溶液、0.9%氯化钠溶液等）的统称[10]。由于PAW 的pH 低，并以活性氧化物（Reactive oxygen species，ROS）、活性氮化物（Reactive nitrogen species，RNS）为其主要活性成分，其对细菌、酵母、霉菌和病毒等微生物具有很强的杀灭效果。研究表明，PAW 不仅能有效地杀灭食品中的微生物，还能维持食品本身的品质不受显著性影响，并且具有操作简单、处理时间短、效率高等优点。

1 低温等离子体活性水（PAW）简介

1.1 PAW 的制备方法

PAW 是由水和低温等离子体相互作用产生的。不同的低温等离子体放电方式、激发电压、电极类型、工作气体组成、水溶液成分、等离子体与液面之间的距离等都会影响产生的PAW 的物理化学性质，从而影响灭菌效果。在食品领域中常用的等离子体源有介质阻挡放电（DBD）、电晕放电和射流等离子体放电等[11]。依据低温等离子体与水的作用方式可将PAW 制备方法大致分为三类：直接在液相放电、在液面上的气相放电和多相环境中的放电，如在液体内的气泡中放电或接触液体喷雾、泡沫放电[12]。几种常用的PAW 产生装置如图1。

1.2 PAW 的活性成分

PAW 的活性作用主要来自于水溶液中的活性成分，包括羟基自由基、原子氧、单线态氧、超氧阴离子、原子氮等短寿命化学成分和过氧化氢、过氧亚硝酸、一氧化氮、亚硝酸盐离子、亚硝酸盐离子等长寿命化学成分[13]。这些活性成分的转移主要发生在等离子体-液体界面，并且涉及许多物理化学反应，如粒子碰撞、界面物质转移、UV 的光解和复杂的化学过程[14-15]。各相中的活性物质见表1[16]。研究表明，ROS、RNS 与H+的联合作用是PAW 灭菌的主要机制，液相中ROS和RNS 的主要化学反应见表2[17]。

表1 等离子体-气体-液体各相活性物质Table 1 Plasma-gas-liquid active substances in each phase

表2 液相中ROS 和RNS 的主要化学反应Table 2 Major chemical reactions of ROS and RNS in the liquid phase

伴随活性物质的产生，PAW 的电导率和氧化还原电位（ORP）也会上升。电导率的上升是因为溶液中的离子浓度（如H+和硝酸根离子）上升，引起溶液的导电能力增强。ORP 值是评价消毒剂的氧化能力的指标之一，能反映消毒剂中氧化性物质的浓度和活性，ORP 值越高，则灭菌效果越好。普遍认为PAW 中ORP 值上升来源于ROS 引起的溶液氧化活性增强。此外，溶液在经低温等离子体处理后pH 值普遍下降到2～3，研究认为PAW 的H+是由氮氧化物溶解于水时产生的[14]，反应式如下：

2 PAW 在食品领域的应用

2.1 PAW 对食品中微生物的影响

食品生产过程中微生物污染是食品工业所面临的巨大挑战。相较于传统的热加工和一些非热加工技术，低温等离子体技术是一种较为温和的处理手段，既能达到有效灭菌的目的，又具有营养损失小、品质破坏小、无毒副作用等优点。表3 展示了近年来PAW对主要微生物的灭活效果和相关参数。

较早的研究认为，只有ROS 对PAW 灭菌作用有贡献，如郭俭[18]认为ROS 中的氧原子和活性氧（如O*、O3）等是杀菌的主要有效成分，而 RNS 对灭菌效果的影响甚微。但是后来的研究表明RNS 在PAW 灭菌过程中也起到了作用。ROS 因其具有强氧化性，首先影响和破坏细胞中抗氧化物质的氧化还原状态，然后附着到细胞表面，作用于细胞壁中的肽聚糖、脂质双分子层中的脂肪酸和细胞膜的主要成分磷脂双分子层，裂解肽键并氧化氨基酸侧链，导致细胞壁破裂、细胞膜通透性改变甚至破裂，最终细胞瓦解，内容物流出，微生物死亡[18]。Wu 等[19]用等离子体处理不同浓度的H2O2溶液，结果表明H2O2浓度越高，PAW 的灭菌效果越强，原因在于H2O2破坏了细胞膜的完整性。Zhang 等[20]研究了PAW 中的ROS 对金黄色葡萄球菌的氧化应激性的影响，发现ROS 不仅破坏了细胞膜的完整性，还渗透到细胞内作用于细胞内容物。但是，RNS 的灭菌机理与ROS 略有不同。在Tian 等[21]的研究中，低浓度NO·自由基的PAW 能促进酿酒酵母细胞生长，而高浓度NO·自由基的PAW 则对细胞有杀灭作用，并认为高浓度的NO·自由基抑制了ATP 的产生和酶活、影响铁离子的代谢途径从而引起细胞损伤，最终导致细胞死亡。目前的研究普遍认为，PAW的灭菌能力来源于 H2O2、NO2-、NO3-和 ONOO-等长寿命化学成分在酸性条件下的协同作用[22]，缺少任何一种物质或是降低其浓度都会使溶液的灭菌能力下降，而增加其中任意一种物质的浓度则能使溶液的灭菌能力增强。不过，目前关于短寿命化学成分对微生物作用的报道较少，更不清楚其作用机制。PAW 中的活性物质的灭菌机理如图2。

除了PAW 中的活性物质的种类和浓度外，影响PAW 灭菌活性的因素还有很多，如金属离子、保存温度、微生物种类、微生物所粘附的环境等等。Chen 等[23]发现产生等离子体的电极材料会使PAW 中带有少量的金属离子（主要是Cu2+和Zn2+），导致PAW 的抗菌能力增强。在Shen 等[24]的报道中，在-80 ℃下保存30 d 的PAW 仍然具有很强的灭菌能力。Kamgang-Youbi 等[25]和叶帼嫔等[26]都证明了微生物的种类对PAW 的灭菌效果有所影响，一般来说，微生物对PAW 的抗性从大到小的顺序依次是真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，灭菌效果与细胞的结构有关。

2.2 PAW 对生鲜果蔬品质的影响

由于内源酶的催化作用和微生物的生长繁殖所导致的腐败，许多新鲜果蔬很难长期保存。目前，已有文献报道了PAW 对新鲜果蔬的保鲜作用。PAW 可有效杀灭果蔬中导致腐败的致病菌，延长果蔬的货架期，且不会对果蔬的品质产生明显的负面影响。

Ma 等[36]用以大气压等离子体射流活化的PAW处理接种过金黄色葡萄球菌的草莓，贮藏4 d 后草莓表面的金黄色葡萄球菌减少了2 log CFU/g，PAW 处理对真菌生长也有一定的抑制作用，且草莓仍能保持鲜亮的红色、完整的组织结构和硬度。在Ma 等[37]的另一项研究中，PAW 处理使杨梅的腐烂率降低了50%左右，贮藏8 d 后细菌和真菌的最大降幅均在1.1 log CFU/g 左右，果实在整个贮藏期相比于对照组表现出更高的硬度和颜色持久度，可溶性固形物含量也相对较高。

Xu 等[38]用PAW 处理新采的双孢蘑菇，贮藏7 d后，细菌和真菌数量分别减少了1.5 和0.5 log CFU/g，同时延缓了蘑菇的软化，但PAW 处理并不影响双孢蘑菇的颜色和抗氧化性能。Xiang 等[39]用PAW 清洗豆芽30 min，豆芽上的总好氧菌、总酵母菌和霉菌的数量分别减少2.32 和2.84 log CFU/g，豆芽的抗氧化能力、总酚和黄酮含量及感官特征等均未发生显著变化。

Andrasch 等[40]用以微波等离子体活化的PAW 和自来水交替清洗鲜切莴苣，使鲜切莴苣表面所携带的微生物减少了2 log CFU/g，但是对莴苣本身品质的影响很小。Choi 等[41]的研究中也提出了一种连续组合清洗泡菜的方法，包括PAW、自来水和60 ℃温和热处理（MH）。单用PAW 清洗就可使泡菜中的好氧菌、乳酸菌、酵母和霉菌以及大肠菌群分别减少2.0、2.2、1.8、0.9 log CFU/g，而随后的MH 处理则将微生物的数量减少到低于检测极限。自来水清洗、PAW、MH 的顺序组合，使接种到泡菜上的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌分别减少了3.4 和3.7 log CFU/g。顺序组合处理使泡菜的盐度和过氧化物酶活性下降，而水分、还原糖含量、硬度和颜色的变化可忽略不计。

2.3 PAW 对水产品和肉类品质的影响

PAW 处理对水产品及肉制品品质的变化也有一定的影响。Liao 等[42]将DBD 活化的PAW 冰用于虾的保鲜，8 d 内虾的TVC 值均维持在6 log CFU/g 以下，TVB-N 值维持在20 mg/100 g 以下，贮藏时间延长了4～8 d。同时，PAW 冰有效地缓解虾头部的黑变过程，减缓虾青素的降解并抑制多酚氧化酶活性，维持虾的硬度。PAW 冰在整个贮藏过程中不会造成对虾的不良降解。PAW 冰处理后虾的总巯基含量和ATP 酶活性均有所下降，但差异不显著。

表3 PAW 的杀菌作用及相关参数Table 3 The sterilization effect and relative parameters of PAW

除了作为保鲜剂，PAW 还可以作为腌制食品的亚硝酸盐替代品。在肉类产品中，亚硝酸盐的主要作用有维持肉产品的颜色、抑制肉毒杆菌的生产、抑制脂类氧化和形成腌肉的独特风味等。Jung 等[43]用DBD放电的方式活化1%焦磷酸钠溶液，用得到的PAW处理乳化型香肠，由于产生的PAW 含有足够的亚硝酸盐（782 mg/L），可作为乳化型香肠的亚硝酸盐来源。PAW 处理的乳化型香肠的品质，如总好氧菌数、颜色、过氧化物含量、感官品质等，都与用亚硝酸钠腌制的香肠相似，且残余亚硝酸盐含量较低，验证了PAW 作为乳化型香肠的亚硝酸盐替代品的可行性。Yong 等[44]也在猪肉火腿上做了类似的研究，同样是用DBD 放电的方式活化1%焦磷酸钠溶液得到PAW。与亚硝酸盐处理组相比，PAW 处理组有较高的亚硝基血红素含量，且PAW 中的亚硝基更易被还原为NO 从而拥有更低的亚硝基残留量。两组的脂类过氧化物值和总好氧菌值无差异，这主要是由呈碱性的PAW 抗菌效果不佳导致的。此外，在沙门氏菌致突变实验和免疫毒性反应测试中，PAW 都没有表现出遗传毒理学问题。故而，PAW 可作为一种相对安全有效的亚硝酸盐替代品应用于腌制肉产品中。

3 总结与展望

由于含有ROS 和RNS 等活性成分，PAW 处理可以有效灭活食品中的微生物，降低消费者感染食源性疾病的风险，且不对食品本身品质产生破坏作用，是一种绿色清洁且安全有效的新型灭菌和保鲜技术，可满足目前市场对绿色无公害产品的追求，已广泛应用在生鲜果蔬和水产品的保鲜、肉产品的加工工艺中。同时，PAW 具有低亚硝基残留的优势，是一种生物安全性更高的亚硝酸盐替代品。但是，目前PAW 在鲜肉中的应用和PAW 钝化食品内源性酶的作用机理还少有报道。此外，PAW 中的短寿命化学成分对微生物的作用机理尚不明确。如何将PAW 运用于工业生产也是下一步需要探究的方向之一。综上所述，PAW在食品领域中具有重要的研究价值，更多的应用领域还有待进一步的开发和研究。