中草药复配液在脐橙保鲜中的应用研究

卢 山 ，杨 坤 ，黄 超，占 晨，黄长干,*

（1.江西农业大学，功能材料与农业应用化学研究所，江西 南昌 330045；2.江西农业大学校友办，江西 南昌 330045）

脐橙属芸香科柑橘属植物，果实色泽鲜艳光滑、品质优良，是世界各国竞相栽培的柑橘良种，因富含大量对人体有益的必需元素及功效成分深受人们喜爱[1]。在我国的江西、湖北、重庆等省市都有广泛种植。而江西的赣南地区已经成为国内脐橙的主要产地，每年都有大量的脐橙销往各地[2]。脐橙易在采摘、贮藏到加工销售等环节中受机械损伤，加剧了呼吸作用和代谢反应，引发一系列生理生化变化[3]，从而造成病原微生物侵染产生病害，其中又以意大利青霉和指状青霉引起的青霉病和绿霉病为最主要的病害[4]。因此，如何对采后脐橙进行抑菌保鲜，减少损失成为亟需解决的重大问题。目前，果农主要使用化学合成杀菌剂如抑霉唑、噻菌灵及苯并咪唑来控制青霉病与绿霉病[5]，但长期使用化学合成杀菌剂，易危害人体健康，也易污染环境和提高病原菌的耐药性[6]。因此，研发广谱、高效、低毒的天然防腐保鲜剂，便成为当今的研究热点之一[7]。

中草药提取物的成分复杂多样，可生物降解、无污染，而且中草药资源丰富、安全无毒、价格低廉，有较好的抑菌杀菌作用，因此愈发受到国内外科研人员的重视和青睐，为研发植物源保鲜剂奠定了良好的物质基础[8]，同时催生了许多对中草药提取物的研究，如丁香精油能显著抑制意大利青霉和指状青霉的菌丝生长和孢子萌发[9-10]，石榴皮提取物对意大利青霉菌的抑制效果与化学杀菌剂抑霉唑无显著性差异[11]，埃塞俄比亚植物Withania somnifera和Acaciaseyal的甲醇提取物对“巴伦西亚”柑橘的防腐保鲜效果与化学合成杀菌剂噻苯达唑无显著性差异[12]。课题组以指状青霉和意大利青霉为靶标菌种，根据前期筛选结果得知：肉桂、丁香、细辛、丹皮、五倍子五种中药的提取液对指状青霉和意大利青霉的抑制作用最为显著[13]，并且肉桂提取液具有最强的抑菌活性[14]。因此，本试验对这五种提取液中的三种提取液进行1∶1∶1 的比例复配研究，选出最佳复配液，考察其稳定性及其在采后脐橙中的保鲜效果，为复配液的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

供试菌种：指状青霉（Penicillium digitatum，菌种编号为ACCC30389）、意大利青霉（Penicilliumitalicum，菌种编号为ACCC 30399），均购于中国农业微生物菌种保藏中心。

肉桂、丁香、细辛、丹皮、五倍子，均购于樟树市华丰药业有限公司；脐橙摘自江西安远金赣丰果园。

试剂：丙酮、盐酸、氢氧化钠、蒽酮、2,6-二氯酚靛酚、TW-80、灭菌水。

1.1.2 仪器与设备

AUY220 型电子天平，UV755B 型紫外分光光度计，日本YAMATO 高温灭菌锅，TS-111C 型恒温培养摇床，TG20 型高速冷冻离心机，HH-1 型恒温水浴锅，Forma-86C ULT Freezer 超低温冰箱。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备

取菌种接种于试管斜面培养基，在30 ℃的环境下培养2～3 d 后，用无菌水将培养基中的菌种冲入装有250 mL 无菌水的锥形瓶中，摇匀，制成孢子菌悬液，使菌液浓度达106/mL。

1.2.2 供试药材提取液的制备

对于上述五种中草药，在60 ℃下烘干，粉碎，过40 目筛，加入4 倍体积的丙酮，置于避光阴凉处，每隔24 h 振荡提取一次，共3 次，摇床摇速为140 r/min，合并滤液后，减压浓缩，用丙酮定容至浓度为1 g/mL。

1.2.3 最佳复配液的筛选

1.2.3.1 复配提取物的抑菌活性测定

对肉桂、丁香、细辛、丹皮、五倍子的提取液任取三种以1∶1∶1 的比例进行复配，各植物提取液浓度均为1 g/mL，一共10 组复配组合，即CM-1（肉桂、丁香、细辛）、CM-2（肉桂、丁香、丹皮）、CM-3（肉桂、丁香、五倍子）、CM-4（肉桂、细辛、丹皮）、CM-5（肉桂、细辛、五倍子）、CM-6（肉桂、丹皮、五倍子）、CM-7（丁香、细辛、丹皮）、CM-8（丁香、细辛、五倍子）、CM-9（丁香、丹皮、五倍子）、CM-10（细辛、丹皮、五倍子）。采用琼脂扩散法测定复配液对供试病原菌的抑制作用，把制好的菌液，吸取5 mL 混入冷却至60 ℃左右查氏培养基，制备带毒培养基。对称放置无菌牛津杯，分别于牛津杯中加入200 μL 生药浓度为1 000 mg/mL的植物提取液，用丙酮作为溶剂对照，置于28 ℃恒温箱中培养24～72 h，用十字交叉法测量抑菌圈的大小[15]。以不加入复配液的带毒培养基为对照组，观察抑菌效果，如果复配液能杀死或抑制培养皿中试验菌的生长，则在牛津杯周围会出现一个无菌生长的透明带即抑菌圈，抑菌圈直径越大，说明浸提液对此种试验菌的抑制效果越好。通过各组复配组合的抑菌效果对比，最终选出最佳复配组合。

1.2.3.2 复配液稳定性的测定

以指状青霉和意大利青霉分别作为供试菌。

（1）将肉桂提取液与最佳复配液分别在日光下放置 0、2、4、8、16、24、48、72 h，进行抑菌试验。

（2）将肉桂提取液与最佳复配液分别在-18、5、30、60、80、100 ℃下处理 1 h 和经高温湿热灭菌（121 ℃）处理30 min 后以进行抑菌试验。

（3）将肉桂提取液与最佳复配液的pH 值用HCl溶液或 NaOH 溶液调成 2、4、5、6、8、10 六个梯度，放置24 h 后进行抑菌试验。

（4）将在常温25 ℃下保存的肉桂提取液以及最佳复配液，每5 d 进行一次抑菌试验，记录其抑菌活性的变化。

1.2.4 供试复配液的制备

将效果最好的复配液用0.2%的TW-80 乳化剂稀释成100 mg/mL 的溶液，该浓度为课题组前期根据采用二倍稀释法[16]测出的最小抑菌浓度。

1.2.5 最佳复配液在脐橙保鲜中的应用

脐橙的保鲜处理需要选择大小一致、无病虫害、成熟度一致和无表面损伤的脐橙。用100 mg/mL 供试复配液浸泡30 s，对照组用清水浸泡30 s，自然晾干。用聚乙烯塑料薄膜袋（32 cm×45 cm，厚度 80 μm）扎口装袋并分别装入2 个塑料水果筐内，先在10～11 ℃环境下贮藏3 d，再搬进冷库（温度为6～7 ℃，相对湿度为85%）进行低温贮藏。定期测定各项生理生化指标。

1.2.6 测定指标与方法

1.2.6.1 总糖含量

采用蒽酮比色法进行测定[17]。

1.2.6.2 可滴定酸含量

采用酸碱滴定法测定[18]。

1.2.6.3 VC 含量

采用2,6-二氯酚靛酚法测定[17]。

1.2.6.4 失重率

1.2.6.5 腐烂率

1.2.7 数据处理

所有试验数据均为3 次重复的平均值和标准差，采用软件SPSS Statistic 25 进行方差分析，采用软件Excel 2010 进行作图。

2 结果与分析

2.1 最佳复配液的筛选

根据课题组前期筛选已发表的肉桂提取液抑菌效果得知：肉桂提取液对指状青霉和意大利青霉的抑菌圈直径为39 mm 和38 mm[13]。从表1 中可看出，10组复配提取液与肉桂单提取液对指状青霉显现出不同程度的抑制效果，其中以CM-7（丁香、细辛、丹皮）复配提取液抑制作用最佳，复配液CM-7 对指状青霉和意大利青霉的抑菌圈直径分别为40.97 mm 和39.03 mm。CM-7 组与其他9 组复配液的抑菌效果相比，差异均显著（P＜0.05）。将复配液CM-7（丁香、细辛、丹皮）组对指状青霉及意大利青霉的抑菌效果与肉桂提取液对指状青霉及意大利青霉的抑菌效果相比，CM-7 组效果更好且差异显著（P＜0.05）。因此，从10 组复配液中筛选出最佳抑菌效果的复配液CM-7组比前期已发表的肉桂提取液抑菌效果更好，为最佳抑菌复配液。

表1 复配提取液的抑菌效果Table 1 Fungistasis effect of compound extract 单位：mm

2.2 复配液稳定性研究

2.2.1 光照对CM-7 稳定性的影响

由图1 可知，随着光照时间的延长，各组中药提取液的抑菌效果逐渐下降。但在16 h 前，CM-7 复配液和肉桂提取液的抑菌效果下降趋势基本一致。16 h以后，肉桂提取液的抑菌效果急剧下降，24 h 之后下降速率趋于平稳，从对指状青霉、意大利青霉抑菌圈直径最大的39 mm 和38 mm 分别降为20 mm和23 mm；而CM-7 复配液抑菌效果的下降速率一直很平稳且相对较高，从对指状青霉、意大利青霉抑菌圈直径最大的41 mm 和39 mm 分别降为31 mm 和32 mm。由此可知，光照时间在20 h 以上时，CM-7 对指状青霉和意大利青霉的抑菌效果极显著高于肉桂提取液（P＜0.01）。

2.2.2 温度对CM-7 稳定性的影响

由图2 可知，CM-7 与肉桂提取液在30 ℃以下的抑菌效果是逐渐上升的，30 ℃时达到顶峰，但是肉桂提取液的稳定性在30～60 ℃之间急剧下降，60 ℃之后下降速率趋于平稳，而CM-7 在30 ℃之后的抑菌效果下降一直都很平稳而且相对较高。温度达30 ℃以上时，CM-7 对指状青霉和意大利青霉的抑菌效果显著高于肉桂提取液（P＜0.05）。

2.2.3 pH 对CM-7 稳定性的影响

由图3 可以得知，CM-7 与肉桂提取液的抑菌效果在pH 2～pH 5 是逐渐上升的，且都在pH 为5 时抑菌效果到达顶峰，随着pH 的升高，CM-7 与肉桂提取液的抑菌效果以大致相同的速率下降。不论pH 如何变化，CM-7 对指状青霉和意大利青霉的抑菌效果与肉桂提取液对指状青霉和意大利青霉的抑菌效果相比，差异性未达显著水平。由此可知，不同pH 对复配液与单提取液稳定性的影响基本一致。

2.2.4 贮藏时间对CM-7 稳定性的影响

由图4 可知，在贮藏20 d 之前，肉桂提取液与CM-7 的抑菌效果大致稳定且保持在较高的水平。但在20 d 之后，随着贮藏时间的延长，肉桂提取液对意大利青霉、指状青霉的抑菌圈直径最大的39 mm 和38 mm 分别降至24 mm 和20 mm；而CM-7 的抑菌效果略有下降，分别从对意大利青霉、指状青霉抑菌圈直径最大的41 mm 和39 mm 降至36 mm 和33 mm。在贮藏时间达25 d 以上时，CM-7 对指状青霉和意大利青霉的抑菌效果显著高于肉桂提取液（P＜0.05）。由此可知，贮藏时间的长短对单提取液稳定性的影响高于对CM-7 稳定性的影响。

2.3 CM-7 在脐橙保鲜中的应用

2.3.1 CM-7 对脐橙总糖含量的影响

由图5 可知，在50 d 之前，对照组与CM-7 处理组的总糖含量随着贮藏时间延长而升高，且变化趋势大致一致。但对照组脐橙总糖含量在50 d 时达到最大值，为15.86%，之后大幅度下降至90 d 时的11.59%；而CM-7 处理组则是继续上升至60 d 时才达到峰值16.26%，之后小幅度下降至90 d 的14.73%。贮藏时间在50 d 以上时，CM-7 处理组脐橙总糖含量显著高于对照组（P＜0.05），这与陈东杰等[19]研究生物保鲜剂对樱桃贮藏中总糖的影响相似。

2.3.2 CM-7 对脐橙可滴定酸含量的影响

由图6 可知，对照组与CM-7 处理组果实中的可滴定酸一直随时间变化而降低，但在70 d 之后对照组中可滴定酸的下降幅度变大，而复配液处理组的下降幅度基本保持不变，对照组中的可滴定酸含量由0.71%（初值）下降至 0.51%（贮藏 90 d）；CM-7 处理组则由0.71%（初值）下降至0.56%（贮藏90d）。随贮藏时间的变化，CM-7 处理组脐橙可滴定酸含量与对照组相比差异不显著。由此可见，CM-7 复配液对脐橙贮藏过程中可滴定酸的影响不大。

2.3.3 CM-7 对脐橙中VC 含量的影响

由图7 可知，对照组与CM-7 处理组果实的VC含量在10 d 时达到最大值，分别为53.81 mg/100 g 和53.04 mg/100 g，之后两组VC 含量都逐渐下降。但是在90 d 时，对照组中VC 含量降低至42.97 mg/100 g，而CM-7 处理组VC 含量降低至46.49 mg/100 g。贮藏时间达30 d 以上时，CM-7 处理组脐橙VC 含量显著高于对照组（P＜0.05）。

2.3.4 CM-7 对脐橙失重率的影响

由图8 可知，前30 d 对照组和CM-7 处理组果实失重率逐渐上升且速率大致相同。但在30～40 d 之间，对照组的失重率急剧上升，40～90 d 之间，对照组失重率变化趋势趋于平稳，最终90 d 时失重率为5.22%；而CM-7 处理组失重率变化则始终相对平缓，到达90 d 时失重率为2.65%。贮藏时间30 d 后，CM-7 处理组脐橙失重率显著低于对照组（P＜0.05）。由此可见，CM-7 复配液在脐橙贮藏过程中能减少果实的失重。

2.3.5 CM-7 对脐橙腐烂率的影响

由图9 可知，在贮藏前20 d，对照组与CM-7 处理组均未出现腐烂个体。对照组在30 d 开始出现腐烂个体，而CM-7 处理组则在60 d 时出现腐烂个体。当贮藏时间到达90 d 时，对照组的腐烂率高达15.56%，而CM-7 处理组则仅有6.67%，二者间差异达极显著水平（P＜0.01）。由此可见，贮藏时间越长，CM-7 复配液越能大幅度延缓果实的腐烂。

3 结论

筛选试验表明，在由5 种中草药提取液中的三种提取液以1∶1∶1 比例配成的 10 种复配液中，CM-7 复配液（丁香、细辛、丹皮）对指状青霉以及意大利青霉的抑菌效果显著高于其余9 组，与肉桂单提取液对指状青霉和意大利青霉的抑菌效果相比也有显著差异。而在长时间光照（＞20 h）、高温（＞30 ℃）或长时间贮藏（＞20 d）条件下，CM-7 复配液的稳定性都显著强于肉桂单提取液，而pH 的变化对两者的影响基本一致。

在贮藏中后期（40～90 d），CM-7 复配液可以明显降低果实的腐烂率和失重率，保证果实的外观；也能延缓果实总糖、可滴定酸和VC 含量的降低，能够保持果实良好的营养品质和风味，延长脐橙的货架期和减少腐烂损失。而总糖、可滴定酸、VC 含量为衡量果实口感的重要因素[20-21]，因此CM-7 复配液能有效维持低温贮藏期间脐橙的品质。但本次试验只研究了复配液的稳定性及其对采后脐橙的保鲜效果，未研究复配液发挥抑菌保鲜作用的主要成分；并且试验提取溶剂为丙酮，虽然以丙酮为溶剂，有着有溶解性好、对细胞穿透力强、成分提取彻底、大多数有效成分均能溶解等优点，但是丙酮也具有毒性，因此选取替代丙酮的低毒溶剂以及复配液中抑菌保鲜的具体成分是什么还有待进一步的研究。