提取方法对荷叶多糖得率及抗氧化活性的影响

邢 颖 景艳芳

(运城学院生命科学系，山西 运城 044000)

荷叶为睡莲科水生植物莲(Nelumbonucifera)的叶片，又被称为莲叶、藕叶，是中国传统的药食同源植物[1-2]。荷叶中含有多种生物活性成分，如多酚、类黄酮、多糖及生物碱等[3]。研究[4]表明，植物多糖对人体具有多种功能，如抗肿瘤、增强免疫力、调节血糖血脂、抗辐射等。

多糖的提取方法主要有热水浸提法、酸碱提取法、超声波辅助法、微波提取法、酶法辅助提取、超高压及超临界萃取法等[5]。汪瑞敏等[6]对比了热水、微波、超声、微波结合超声4种提取方式对天麻多糖含量及抗氧化活性的影响，洪军等[7]对比了热水、超声波及微波对禹州漏芦多糖提取率、抗菌及抗氧化的影响。而不同提取方法对荷叶多糖的影响尚未见报道。试验拟采用热水法、碱法、超声波法及酶法4种提取方式对荷叶多糖进行提取纯化，并以DPPH·、ABTS+·、·OH及还原力为指标分析荷叶粗多糖的抗氧化活性，旨在为荷叶多糖的加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

干荷叶：60 ℃烘至恒重，粉碎后过0.25 mm筛，4 ℃密封保存备用，市售；

无水乙醇、三氯甲烷、乙醚、氢氧化钠、盐酸、硫酸、过硫酸钾、葡萄糖、过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸、溴化钾：分析纯，天津大茂化学试剂厂；

纤维素酶：≥30 U/mg，西陇化工有限公司；

VC：分析纯，西陇化工有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

数控超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司；

循环水真空泵：SHZ-DⅢ型，郑州英峪予华仪器有限公司；

紫外—可见分光光度计：UV-5200型，上海元析仪器有限公司；

pH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

离心沉淀机：LXJ-Ⅱ型，上海医分仪器制造有限公司；

粉末压片机：769YP-15A型，天津市科器高新技术公司；

傅立叶红外光谱分析仪：NICOLET380型，天津天光光学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荷叶多糖的提取

(1) 超声波法：称取一定量荷叶粉，加入20倍量蒸馏水，超声功率400 W，提取时间40 min，提取两次，抽滤，合并提取液。

(2) 热水法：称取一定量荷叶粉，加入20倍量蒸馏水，90 ℃水浴提取两次，每次2 h，抽滤，合并提取液。

(3) 酶法：称取一定量荷叶粉，按固液比1∶15(g/mL)加入蒸馏水，加入0.1 g纤维素酶，用缓冲溶液调节pH为4.5，50 ℃恒温震荡1 h，提取两次，抽滤，合并提取液。

(4) 碱法：称取一定量荷叶粉，按固液比1∶20(g/mL)加入1.2 mol/L氢氧化钠溶液，60 ℃提取2 h，提取两次，抽滤，合并提取液。

1.2.2 荷叶多糖的纯化 采用Sevag脱蛋白、醇沉静置过夜，3 500 r/min离心20 min，取杯底沉淀冷冻干燥，即荷叶粗多糖。

1.2.3 多糖含量测定 采用苯酚—硫酸法[8]。称取10 mg粗多糖定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的粗多糖溶液。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.615X+0.028 9，R2=0.995 7，并按式(1)计算多糖得率。

(1)

式中：

Y——多糖得率，mg/g；

C——荷叶粗多糖配制液中多糖浓度，mg/mL；

V——配制液体积，mL；

M——荷叶质量，g。

1.2.4 红外光谱表征 取粗多糖1 mg进行溴化钾压片，扫描范围400～4 000 cm-1，扫描次数15～16次。

1.2.5 抗氧化活性测定

(1) DPPH·清除能力：参照文献[9]并修改。取不同浓度的多糖溶液2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液4 mL，摇匀，避光反应1 h，测定517 nm处吸光度值。以蒸馏水作空白对照，VC作阳性对照，并按式(2)计算DPPH·清除率。

(2)

式中：

S1——自由基清除率，%；

A0——空白组吸光度；

A——样品吸光度。

(2) ABTS+·清除能力：参照文献[10]并修改。取7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾溶液各0.2 mL，混匀，暗处反应12～16 h形成ABTS+·母液，用无水乙醇稀释至A734 nm为0.68～0.72。取多糖溶液0.8 mL，加入ABTS+·溶液3.2 mL，摇匀，避光反应10 min，测定734 nm处吸光度值，以无水乙醇作空白对照，VC作阳性对照，并按式(2)计算ABTS+·清除率。

(3) ·OH清除能力：参照文献[11]并修改。取1 mL多糖溶液，加入9 mmol/L乙醇—水杨酸溶液、9 mmol/L FeSO2溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液及蒸馏水各1 mL，摇匀，37 ℃水浴30 min，冷却，测定吸光度值。用蒸馏水代替样液作空白对照，蒸馏水代替H2O2溶液作样品对照，VC作阳性对照，按式(3)计算·OH清除率。

(3)

式中：

S2——·OH清除率，%；

A0——空白对照组吸光度；

Ax——样品吸光度；

Ax0——样品对照组吸光度。

(4) 还原力：参照文献[12]并修改。取1 mL多糖溶液，依次加入2 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1%铁氰化钾溶液，摇匀，50 ℃水浴20 min，冷却，加入2 mL 10% TCA溶液、2 mL蒸馏水、0.4 mL 0.1% FeCl3溶液，摇匀，50 ℃保温10 min，测定700 nm处吸光度值，以VC作阳性对照，蒸馏水作空白对照。

1.2.6 数据处理 试验数据均为3次重复的平均值，表示为“平均值±标准偏差”，采用SPSS 15.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 多糖得率比较

由图1可知，不同提取方法对多糖得率影响差异显著(P<0.05)，其中超声波法的得率最高，为14.11 mg/g，其次为酶法和热水法。超声波作用过程中其空化作用、机械作用可加速荷叶细胞壁的破碎，有利于胞内物质的释放，提高多糖浸出率，且超声波法相比于其他提取方式明显节约时间[13-14]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2 红外光谱分析

图2 荷叶多糖红外光谱图

2.3 抗氧化活性比较

2.3.1 DPPH·清除能力 由图3可知，4种荷叶粗多糖浓度在0.013～0.520 mg/mL范围内对DPPH·有一定的清除能力，且随多糖浓度的增大而增强，并呈明显的剂量依赖性，其清除率大小依次为热水法>超声波法>碱法>酶法。当样液浓度为0.013 mg/mL时，热水法提取的多糖对DPPH·的清除率为VC的0.23倍，而酶法提取的仅为VC的0.03倍。

图3 粗多糖的DPPH·清除能力

2.3.2 ABTS+·清除能力 由图4可知，4种荷叶多糖对ABTS+·有一定的清除能力，且随多糖浓度的升高依次增大，并呈剂量依赖关系，其清除能力依次为热水法>超声波法>碱法>酶法，当多糖浓度为0.52 mg/mL时，其清除率分别为85.9%，87.9%，79.4%，76.5%，均低于VC的。

图4 粗多糖的ABTS+·清除能力

2.3.3 ·OH清除能力 由图5可知，4种荷叶多糖对·OH的清除能力随多糖浓度的增加而增加，并呈剂量依赖关系，但远不如VC的。当多糖浓度为16 mg/mL时，热水法、超声波法、酶法及碱法提取粗多糖的清除率分别为30.22%，27.90%，26.20%，25.80%。

图5 粗多糖的·OH清除能力

2.3.4 还原力 由图6可知，4种荷叶粗多糖均具有一定的还原力，且随浓度的增大而增强，但相比于VC，其还原力较弱。当多糖浓度为8 mg/mL时，热水法和碱法的A700 nm达2.91，2.89，而超声波法和酶法的A700 nm仅为0.93，0.81。

图6 粗多糖的还原力

3 结论

试验表明，超声波法、酶法、热水法及碱法4种提取方式的多糖得率依次为14.11，11.83，11.60，8.19 mg/g，且红外光谱相似，均具有典型多糖的特征吸收峰。当浓度为0.013～0.520 mg/mL时，4种粗多糖对DPPH·和ABTS+· 具有显著的抗氧化活性；当浓度为0.39～8.00 mg/mL 时，4种粗多糖对还原力和·OH的清除效果较好，且清除率与多糖浓度呈正相关，其中热水法和超声波法的抗氧化活性较好，但均低于VC的。综上，超声波法的多糖得率最高，抗氧化活性较强，提取时间最短。后续可对荷叶多糖的单糖组成及活性进行研究。