应用D-异抗坏血酸钠分光光度法快速检测血清百草枯含量在临床的意义＊

胡卡利 ，陈晓兵 ，李小民 △，王 丽 ，刘 华 ，沙 鸥

（1.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；2.南京医科大学康达学院第一附属医院检验科，江苏 连云港222000；3.南京医科大学康达学院第一附属医院急诊科，江苏连云港222000；4.江苏龙灯化学有限公司，江苏 连云港222000；5.江苏海洋大学化学工程学院，江苏 连云港222000）

百草枯中毒是我国农药中毒死亡率较高的疾病之一，百草枯中毒死亡率与中毒剂量、洗胃时间长短等多种综合因素有关[1]，目前临床检测百草枯的方法没有统一标准，各级医院检测方法各不相同，百草枯中毒又多发生在农村等基层医疗机构，如何快速有效、经济、简便的临床预判，一直是基层医院所面临的一大难题，前期，我们建立以一种新的检测方法，检测尿中百草枯的浓度[2]，由于受患者排尿的影响，测定尿中百草枯浓度有一定时间延迟性，为方便快速的检测血中百草枯浓度，为此，我们建立了一种快速简洁的测定方法，并应用于临床，现总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象均来自南京医科大学康达学院第一附属医院急诊科2014年1月至2017年12月收治的40例百草枯中毒患者，均为主诉口服百草枯，女性 30 例，年龄 36.0（22.4～49.3）岁，男 性 10 例，年龄30.0（21.0～52.6）岁；所有患者均为口服百草枯30min以后来院就诊。患者入院后常规彻底洗胃、导泄等基本处理，依据《百草枯中毒诊断与治疗“泰山共识”》[3]，均予以目标导向性血液灌流等标准治疗[4]，依据患者存活情况，分为死亡组25例、存活组15例。纳入患者：口服、就诊时间＜24h者。排除患者：①既往有严重心、肝、肾、呼吸系统等疾病病史者；②就诊时间＞24h者；3.48h内死亡者。

1.2 仪器及试剂

TU-1901型分光仪（北京普析），百草枯（中国药品生物制品检测所，含量为99.0%），百草枯储备液（浓度1g/L，临用时逐级稀释），6mol/L的NaOH溶液；D-异抗坏血酸钠（含量98%）。

1.3 实验方法

量取0.1～1.0 mL浓度100 μg/L百草枯标准品液于5mL的比色管中，依次加入0.2mL、6.0mol/L NaOH溶液，0.5mL、24.84g/LD-异抗坏血酸钠溶液，用双蒸水稀释至刻度线，摇匀。以试剂空白做参比，采用TU-1901双光束紫外分光光度仪，测定604nm处的吸光度，方法同前期检测尿中百草枯的浓度[2]。

1.4 标本采集及保存

本研究中血清均由南京医科大学康达学院第一附属医院急诊科提供，包括健康人体血清与百草枯中毒患者血清，健康人体血清样本中加入标准百草枯溶液，作为对照。

2 结果

2.1 波长的选择

在（300～800）nm 波长内对百草枯、D-异抗坏血酸钠，以及百草枯+D-异抗坏血酸钠+NaOH进行光谱测定如图1所示，以相应试剂作空白对照，实验表明，在往待测定的百草枯溶液中加入D-异抗坏血酸钠和NaOH后，呈现蓝色反应，并在395和604nm波长处有两处吸收峰，在395nm波长处有最大峰值，但在该波长下，其他物质干扰大、吸光度不稳定；604nm处又一吸收峰，该峰值稳定、无干扰。本实验选择604nm作为波长选择。

图1 吸收曲线

2.2 NaOH用量选择

实验结果表明，伴随NaOH用量的增加，吸光度亦随之增加，当6mol/LNaOH用量在0.15～0.5mL时，吸光度达到最大，且稳定，故实验选择0.2mL，质量浓度为6mol/L的NaOH溶液。

2.3 反应时间选择

实验结果表明，吸光度在4min后稳定，20min内保持不变；20min后逐步降低。因此，选择反应后4min进行测定，20min内测完。

2.4 回归方程的制定

配比不同质量浓度的百草枯溶液，按照实验方法，测定吸光度。实验表明，百草枯浓度在0.5～20.0mg/L范围内，与吸光度A有良好的正相关线性，线性回归方程 A=0.03897C+0.02408（mg/L）；线性相关系数R=0.997；表观摩尔吸光系数ε=1.01×104L/(mol·cm)。

2.5 干扰实验

本实验控制误差在（±5%），百草枯浓度固定为5mg/L，测定常规正负离子对实验结果的影响。结果显示：在 500 倍的（K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Sn2+、SO42-、Br-、NO3-）；250 倍的（Pb2+）；20 倍的（Ca2+、Ni2+）及 5 倍的（Fe3+、Cu2+）等离子均不影响测定结果。

2.6 中毒患者血清百草枯浓度

我们所测定的40例患者中，有3例测定浓度小于最低测定浓度0.3ug/mL，40例中毒患者，其中存活组15例、死亡组25例，检测其血清百草枯浓度（表1），测定结果表明，存活组浓度明显较死亡组低，差异有统计学意义，随着测定浓度的增加，死亡率也逐渐增加，两者呈正相关性，相关系数rp=0.842。

表1 百草枯中毒患者血清浓度

3 讨论

D-异抗坏血酸钠有较强的还原性，本研究利用其在碱性条件下百草枯能与D-异抗坏血酸钠生成蓝色自由基的化学反应特性，采用比色法来检测血中百草枯浓度，系统的摸索出了D-异抗坏血酸钠、氢氧化钠用量以及显色时间等因素影响关系[2]，在最佳条件下，对血清百草枯的浓度进行了检测，并将实验测定结果应用于临床，我们发现此方法与传统的连二亚硫酸钠法测定方法进行对比，该方法能消除血浆本身颜色因素对测定结果的影响，测定结果的灵敏度高，检测极限可达0.1μg/mL。

虽然国家对百草枯禁售的施行，但一些新型掺售原始的百草枯的农药依旧不绝，这给临床工作初期带来困惑，在轻、中度中毒患者中，初期临床症状不十分明显，在不十分肯定是否为百草枯中毒时，利用本方法可以测定出低剂量的百草枯含量，为临床工作带来理论依据。我们在实际40例的临床检测过程中发现，存活组血清浓度明显较死亡组低，差异有统计学意义，随着测定浓度的增加，死亡率也逐渐增加，血清浓度与死亡率呈正相关性。这也为重度中毒患者提供了重要临床决策方案。

目前，百草枯的分析检测方法主要有色谱法、分光光度测定法、气相色谱法、液相色谱法及毛细管电泳法和质谱联用法等[5-9]。气相色谱法操作比较复杂；质谱联用检测仪器、设备昂贵，技术难度高，难推广应用；毛细管电泳技术耗时长[10]。这几类检测方法均不适合基层医院。D-异抗坏血酸钠测定法所需设备简单、原材料来源广泛、测定程序少、方法简便、结果灵敏可靠、稳定。同时还可以测定尿中百草枯中毒含量[2]，值得在基层医院推广。