大孔树脂纯化平卧菊三七总有机酸工艺研究

赵玉荣，曾 锐，张艺蓉，陆姗姗

（南京中医药大学翰林学院，江苏泰州 225300）

0 引言

平卧菊三七Gynura procumbens Lour.为菊三七属多年生草本植物，具有降糖、降血脂、抗氧化等功效［1-3］，有研究表明总有机酸是其抗氧化作用的有效组分之一［4］。前期研究发现平卧菊三七中抗氧化成分主要集中在乙酸乙酯部位，并通过液质联用技术鉴定了其主要含有有机酸类成分，如绿原酸、阿魏酸等［5］。同时，应用星点设计-响应面法优化了平卧菊三七中绿原酸的提取工艺［6］。近年来，大孔树脂被广泛应用于有机酸的提取工艺纯化中。因此，本研究通过比较不同大孔树脂的静态吸附与解吸附性能，筛选出分离纯化平卧菊三七总有机酸的最优树脂，并对上样质量浓度、乙醇洗脱浓度、乙醇洗脱体积进行优化，为合理开发利用平卧菊三七资源提供理论基础。

1 仪器与材料

平卧菊三七（江苏省野生蔬菜研究所），大孔树脂DM301（批号：2019-012），DM130（批号：2019-003），HPD100（批号：2019-005），HPD450（批号：2018-079），AB-8（批号：2018-090），均购于郑州勤实科技有限公司。一水合柠檬酸（国药集团化学试剂有限公司），邻苯二甲酸氢钾（上海凌峰化学试剂有限公司），NaOH固体颗粒（西陇科学股份有限公司）。KH-500B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；THZ-82恒温振荡器（华药企业），pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 提取物的制备

称取平卧菊三七药材500 g，加入10倍量80%乙醇，80℃回流提取1 h，重复提取3次，抽滤，合并提取液。减压浓缩至终体积为500 mL，以等体积石油醚萃取3次除杂，保鲜膜密封，4℃保存备用。

2.2 NaOH溶液浓度的标定

取100℃烘干至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.418 0 g，酚酞为指示剂，滴定配制的NaOH溶液，平行测量3次，取平均值。测得NaOH溶液的准确浓度为0.096 4 mol/L。

2.3 总有机酸的测定

参考朱晨晨等［7］方法，采用电位滴定法测定总有机酸。取平卧菊三七提取液或柠檬酸适量，加水溶解，定容，精密取，按电位滴定法，即将pH复合电极插入液面下，开启搅拌，确保滴定过程中待测溶液中浓度均匀，用上述标定的NaOH滴定，测量有机酸的含量。采用Excel 2010版绘制一阶导数曲线（ΔE/ΔV）-V。一阶导数曲线最高点对应的体积即为滴定终点体积，以柠檬酸计算总有机酸含有量。

2.4 柠檬酸消耗的标准NaOH的量

称取柠檬酸0.135 0 g，用适量的蒸馏水溶解，充分吸收，已标定的NaOH滴定柠檬酸溶液进行测量。如图1所示，曲线的极大值对应体积就是滴定终点，消耗碱量为20.05 mL，即为滴定突跃点。计算为每消耗每1 mL NaOH滴定液（0.096 4 mol/L）相当6.020 9 mg的柠檬酸。

图1 柠檬酸对照品一阶导数滴定曲线

2.5 平卧菊三七提取液中总有机酸测定

取平卧菊三七提取液1 mL，蒸馏水定容至50 mL，超声溶解，用上述NaOH溶液滴定，结果如图2所示。平卧菊三七粗提取液滴定至NaOH溶液消耗体积为1.75 mL时存在明显的滴定突跃，即每1 mL的平卧菊三七提取液中含有相当于10.536 6 mg的柠檬酸量。

图2 平卧菊三七提取液中平卧菊三七提取液中总有机酸一阶导数滴定曲线

3 酸纯化工艺优化

3.1 大孔树脂预处理

取DM301，DM130，HPD100，HPD450，AB-8大孔树脂200 g，用95%乙醇浸泡溶胀24 h，湿法装柱，用2 BV的95%乙醇洗脱，以蒸馏水冲洗至无醇味，备用。

3.2 大孔树脂的筛选

3.2.1 静态吸附-解析性能考察实验

称取树脂各5 g，置于50 mL锥形瓶中，加入平卧菊三七提取液5 mL，置于水浴振荡器中振荡2 h，待充分吸收后过滤，取蒸馏水洗涤大孔树脂，转移至锥形瓶中，再加入50%乙醇30 mL，置于水浴振荡器中，充分振荡，测定吸附率和解吸率进行比较，公式为吸附量=（C0-V1）V1/m；解吸量=C2V2/m；吸附率=［（C0-C1）/C0］×100%；解吸率=解吸量/吸附量×100%（C0为总有机酸初始质量浓度，C1为吸附平衡后总有机酸质量浓度，C2为解吸后总有机酸质量浓度，V1为吸附液体积，V2为解吸液体积，m为大孔树脂质量），实验结果如表1所示。

表1 5种大孔树脂对平卧菊三七总有机酸静态吸附的影响

结果显示：HPD100，DM301，HPD100对有机酸都有较高的解析率，但HPD450在预处理阶段颗粒大小不均一，容易分层，实验结果不稳定，故不采用；HPD 100和DM301的吸附量和解析量都比较高，做动态吸附，进一步筛选最优树脂。

3.2.2 动态吸附-解析性能察实验

取5种类型的树脂10 g，装入统一规格的色谱柱（2.0 cm×40 cm），量取5 mL样品溶液，加蒸馏水30 mL进行稀释，用蒸馏水冲洗树脂直至流出液基本无颜色，用NaOH溶液滴定液滴定，测定有机酸含量，如表2所示。

表2 5种大孔树脂对平卧菊三七中总有机酸动态吸附的影响

综合结果显示DM301对平卧菊三七提取液中的有机酸成分有较高的吸附率，HPD100静态吸附虽然较高而且动态比吸附量最高，但是比解析量较少，导致动态的解析率只有48.34%，故采用DM301为最优树脂。

4 大孔树脂对平卧菊三七总有机酸纯化工艺研究

4.1 上样质量浓度对平卧菊三七提取液有机酸吸附量的影响

取DM301大孔树脂3 g，置于50 mL锥形瓶中，分别量取3.32，5.07，7.18，7.61，8.51 mL的母液，然后加水定容至10 mL，配成3.5，5.34，7.57，8.02，8.97 mg/mL的总有机酸，放入水浴振荡器中振摇2 h，待充分吸附后过滤，用上述NaOH溶液滴定，测定比吸附量，比较上样浓度。

结果显示，上样质量浓度在3.5～7.57 mg/mL时，吸附量随着浓度的增加而增加，而达到7.57 mg/mL后吸附量随着变化量的增加而逐渐减少，考虑到上样液质量浓度过高时易堵塞树脂，所以上样质量浓度在7.57 mg/mL时为最佳上样质量浓度，如图3所示。

图3 上样质量浓度对平卧菊三七提取液有机酸吸附量的影响

4.2 乙醇体积分数对平卧菊三七提取液中有机酸解吸附的影响

取DM301树脂3 g，置于50 mL锥形瓶，加入5 mL质量浓度为7.57 mg/mL总有机酸，加水定容到10 mL，放入水浴振荡器中振摇2 h后，取出过滤，用蒸馏水冲洗树脂直至流出液基本无颜色，再取30 mL体积分数为50%，70%，90%，95%的乙醇冲洗树脂，放于水浴振荡器中，振摇2 h，充分吸附后取出过滤，测量溶液解析率，结果如图4所示。

结果显示，乙醇体积分数在50%～90%时随着乙醇体积分数的增加而增加，当乙醇体积分数为90%时解析率达到最高，当体积分数超过90%时，解析率随着乙醇体积分数的增高而减少，所以当乙醇体积分数为90%时解析率最高。

图4 乙醇体积分数对平卧菊三七提取液中有机酸解吸附的影响

4.3 乙醇体积对平卧菊三七提取液有机酸解吸附的影响

取DM301树脂3 g，置于50 mL锥形瓶，加入5 mL浓度为7.57 mg/mL总有机酸，定容到10 mL，放入水浴振器中振摇2 h后，用蒸馏水冲洗树脂直至流出液基本无颜色，再用2，4，6，8 BV的90%乙醇洗脱树脂，放入水浴振荡器中，振荡2 h，等溶液充分吸收后，过滤得到滤液，测定解吸附量，比较解析率，结果如图5所示。

图5 乙醇体积对平卧菊三七有机酸解吸附的影响

结果表明，2 BV的90%乙醇洗脱就可以将总有机酸洗脱下来，同时考虑到节约试剂，故选择2 BV的90%乙醇为洗脱溶剂。

4.4 总有机酸纯化工艺验证

取DM301树脂3 g，置于50 mL锥形瓶，加入5 mL质量浓度为7.57 mg/mL总有机酸，定容到10 mL，放入水浴振器中振摇2 h后，用蒸馏水冲洗树脂直至流出液基本无颜色，再用2 BV的90%乙醇洗脱树脂，放入水浴振荡器中，振荡2 h，等溶液充分吸收后，过滤得到滤液，用“2.5”项下方法测定滤液中总有机酸的浓度，测得结果为每1 mL的平卧菊三七提取液中含有相当于15.054 3 mg的柠檬酸量，与初始提取液中总有机酸的含量（初始含量为每1 mL中含有相当于10.536 6 mg的柠檬酸量）相比，提高了42.88%。

5 讨论

有机酸是平卧菊三七的主要化学成分，其具有显著的抗氧化作用。因此，分离纯化平卧菊三七总有机酸对研究其药理作用具有重要的意义。

根据有机酸结构及性质的差异，常采用的分离纯化方法有酸碱法、离子交换树脂法、大孔树脂吸附法、活性炭吸附法等［8-9］。大孔树脂是一类不溶于酸、碱及各种有机溶剂的高聚物吸附剂，具有价格便宜、选择性好、操作简单、适用于范围广等优点，在很多领域都有广泛的应用，但还未应用到平卧菊三七总有机酸的研究。因此，本实验可为平卧菊三七中总有机酸成分的纯化工艺提供理论依据。