益肾降浊冲剂对慢性肾衰大鼠肾组织细胞凋亡及BAX、Bcl-2蛋白表达的影响*

★ 伞勤 郑敏麟** 刘广 骆丹岚 阮诗玮（.福建中医药大学中西医结合学院 福州350；.福建中医药大学附属人民医院 福州 350004）

益肾降浊冲剂有“健脾益气，补脾益肾，培土制水”的功效，在福建中医药大学附属医院用于治疗慢性肾功能衰竭（chronic renal failure， CRF）已有20余年。其可有效降低CRF患者血清肌酐（serum creatinine， Scr）、尿 素 氮（blood urea nitrogen， BUN）水平，改善临床症状，有效延缓CRF进程，疗效确切。吴竞等［1]研究证明，西药配合益肾降浊冲剂治疗在延缓肾功能方面较单纯西药治疗明显更有优势，其可有效降低患者血清BUN、Scr，改善患者血清内皮素水平，可明显改善患者临床症状。有研究发现，益肾降浊冲剂可以改善CRF患者血清钙磷代谢及降低成纤维生长因子23水平，进而延缓病情进展［2]。

此前，作者曾采用5/6肾切除大鼠CRF模型，同时用大黄素作为治疗对照组，观测用益肾降浊冲剂治疗慢性肾功能衰竭的疗效，并初步探讨CRF“肾小管高代谢学说”的深层机理和益肾降浊冲剂作用机制。实验结果发现：模型组的肾脏的病理和超微结构损伤最重，线粒体肿胀明显，且血浆MDA水平显著增高，SOD水平显著降低，而经益肾降浊冲剂干预，以上改变能明显减轻［3-4]。

本研究在此前对益肾降浊冲剂治疗5/6肾大部切除术CRF大鼠实验结果的基础上，继续观测益肾降浊冲剂治疗对5/6肾大部切除术CRF大鼠的肾脏组织细胞凋亡及对Bcl-2、BAX蛋白表达的影响；基于线粒体介导的细胞凋亡途径，对益肾降浊冲剂的药物作用靶点和药理机制进行了进一步的深入探讨。

1 材料及方法

1.1 实验动物60只健康的清洁级SD雄性大鼠，购至中科院上海动物饲养中心，合格证号：2015000535181，许 可 证 号：SCXK（沪）2012-0002，喂养于福建中医药大学动物中心。体重180～220g，自由进食进水。饲养于自然光条件，湿度为50%～70%，恒温。

1.2 试剂益肾降浊冲剂（购自福建中医药大学附属第三人民医院），由生黄芪30g、太子参15g、白术15g、茯苓15g、玉竹15g、当归15g、桑椹15g、桑寄生15g、怀牛膝15g、丹参15g、山楂15g、陈皮15g、大黄15g、六月雪15g、车前子15g组成。大黄素（北京索莱宝科技有限公司）；HE染色试剂盒（源叶公司）；Tunel试剂盒（上海罗氏）；Bcl-2、BAX多克隆抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；DAB显色剂（福州迈新公司）。

1.3 分组与造模60只实验用大鼠适应性喂养7d后，随机取48只行腹腔麻醉后。以腹卧位在大鼠左背部手术区去毛，并常规消毒及铺巾，沿左肋脊角做约2.0cm斜切口，从腹侧往切口托出肾脏充分暴露左肾后，钝性分离肾周脂肪囊，迅速弧形切除共占左肾皮质2/3的上、下两极皮质，立即滴加凝血酶并纱布按压止血，复位肾脏，缝合组织；1周后切除右肾［5]。另12只以同样程序进行，但不切肾脏，为假手术组。切除肾脏的48只大鼠随机均分为模型组、大黄素治疗组及大、小剂量益肾降浊冲剂组。益肾降浊冲剂小剂量组，每日灌服益肾降浊冲剂6g/kg，益肾降浊冲剂大剂量组，每日灌服18g/kg，大黄素治疗组，每日灌服大黄素50mg/kg。假手术组和模型组灌服相同量的蒸馏水。

1.4 指标检测

1.4.1 血清肾功能指标检测 离心管收集腹主动脉（非抗凝）血液，离心收集血清以备测BUN、Scr含量。

1.4.2 肾脏组织病理改变检测 取左肾组织固定于4%多聚甲醛24h后，进行石蜡包埋，切4μm切片进行摊片、捞片，58℃烘片后脱蜡、脱水处理，苏木素染色15min，伊红染色30s，透明并树胶封片，光学显微镜观察形态结构变化并拍片。

1.4.3 Tunel染色检测细胞凋亡 切片后，常规脱蜡、脱水，PBS洗涤3次，加入内源性过氧化物酶阻断剂孵15min。PBS清洗3次，吸出组织上多余液体，滴加0.1% Triton X-100透化液，常温孵育8min。甩去玻片上的溶液并用PBS洗涤三次。吸出组织上多余液体，将TUNEL反应混合液滴加在组织上，避光孵育60min。PBS清洗后，滴加Converter-POD，保湿孵育30min。PBS洗涤，在显微镜观察下滴加DAB显色。苏木素复染，脱水、透明、封片。显微镜观察并随机选取视野进行拍照。

1.4.4 免疫组化染色检测BAX、Bcl-2凋亡蛋白 取石蜡包埋的肾组织，4μm切片后，行脱蜡水化，微波热修复8min。冷却后PBS洗涤，室温下山羊血清封闭20 min后，滴加一抗4℃过夜。次日，PBS洗涤后滴H2O2 孵育10 min。再次PBS洗涤后，滴二抗室温孵育1h，PBS清洗，DAB显色3～5min，显微镜下观察显色程度，自来水冲洗，苏木素染核2min，盐酸酒精分化，自来水冲洗15min，酒精脱水，二甲苯透明，封片，显微镜观察并拍片。

1.5 统计方法结果采用SPSS 22.0 软件包进行统计学分析，实验数据以表示，多组数据分析采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清肾功能指标的比较见表1。与假手术组比较，模型组大鼠血清Scr和BUN值明显上升（P＜0.05）；与模型组比较，益肾降浊冲剂大剂量和大黄素组Scr和BUN值明显下降（P＜0.05）。且与大黄素组比较，益肾降浊冲剂大剂量组血清Scr和BUN值明显下降（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠肾脏组织病变的比较见图1。与假手术组相比，模型组肾小球明显变性、数量减少，肾小囊腔和肾小管管腔出现明显扩张，其特征在于囊腔内有轻微染色的蛋白性液体，足细胞空泡变性，部分肾小管出现蛋白管型，坏死处可见大量淋巴和单核细胞浸润；与模型组相比，益肾降浊冲剂大剂量组和大黄素组的肾脏组织肾小球病变有明显改善，肾小囊腔和肾小管扩张减轻，蛋白管型明显减少，淋巴和单核细胞浸润明显减少。

表1 各组大鼠血清肾功能对比（，n=12）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与大黄素组比较，△P＜0.05。

组别 模型组 假手术组 大黄素治疗组 益肾降浊冲剂大剂量组 益肾降浊冲剂小剂量组BUN 18.63±2.67 7.42±0.92*△ 16.33±1.95* 14.23±1.76*△ 18.47±2.25 Scr 120.96±20.43 41.56±10.80*△ 95.88±10.88* 82.40±8.35 *△ 114.08±19.51

图1 各组大鼠肾组织HE染色图片（spx200）

2.3 各组大鼠细胞凋亡的比较见图2和表2。与假手术组比较，模型组凋亡数明显上升（P＜0.05）；与模型组比较，益肾降浊冲剂大剂量组和大黄组凋亡指数明显下降（P＜0.05）；且益肾降浊冲剂大剂量组凋亡数明显少于大黄组（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肾组织Tunel染色图片（spx400）

表2 各组大鼠肾细胞凋亡数比较（，n=12）

表2 各组大鼠肾细胞凋亡数比较（，n=12）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与大黄素组比较，△P＜0.05。

分组 模型组 假手术组 大黄素组 益肾降浊冲剂大剂量组 益肾降浊冲剂小剂量组凋亡数 911.40±91.81 191.60±42.69*△ 487.00±77.83* 266.60±59.50*△ 905.60±76.47△

2.4 各组大鼠BAX、Bcl-2在肾脏组织表达的比较见图3和表3。与假手术组比较，模型组BAX表达明显上升（P＜0.05）；与模型组比较，益肾降浊冲剂大剂量组和大黄素组BAX表达明显下降（P＜0.05）；与假手术组比较，模型组Bcl-2表达明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，益肾降浊冲剂大剂量组和大黄组Bcl-2表达明显上升（P＜0.05）。且与大黄素组比较，益肾降浊冲剂大剂量组BAX表达明显减少，Bcl-2表达明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图3 各组大鼠肾组织BAX、Bcl-2蛋白表达图片（spx400）

3 讨论

益肾降浊冲剂，是福建省名中医阮诗玮教授的经验方，方以生芪、太子参、白术、茯苓健脾益气、培土制水，为君药；大黄活血排毒泄浊，邪去则正安而脾健，为臣药；山楂、当归、玉竹、桑椹，佐君药滋脾肾之阴以助运，益母草、六月雪佐臣药大黄以活血排毒泄浊，共为佐药。以陈皮为使，俾君药补而不滞，脾气周流而水邪得制。全方具有健脾益肾、祛瘀泄浊的功效，恢复“脾制水”的功能，攻补兼备，促进体内尿毒症毒素的排出。

表3 各组大鼠肾组织BAX和Bcl-2的表达（，n=12）

表3 各组大鼠肾组织BAX和Bcl-2的表达（，n=12）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与大黄素组比较，△P＜0.05。

组别 模型组 假手术组 大黄素治疗组 益肾降浊冲剂大剂量组 益肾降浊冲剂小剂量组BAX 1157.40±123.31 224.80±51.64*△ 796.60±40.64* 505.20±14.04*△ 1027.00±98.39 Bcl-2 157.60±38.66 789.00±73.23*△ 412.80±70.96* 559.60±73.15*△ 194.80±67.01

细胞凋亡是程序性细胞死亡的主要模式，在组织稳态的发展与维持中起重要作用。它主要有两种凋亡信号通路：死亡受体介导的外在途径及线粒体介导的内在途径［6]。Bcl-2家族的蛋白质是内在途径的关键调节因子，包括促凋亡的BAX蛋白和抑凋亡的Bcl-2蛋白。异源二聚体由Bcl-2和BAX蛋白共同组成，可抑制细胞凋亡；同源二聚体由BAX蛋白组成，促进细胞凋亡［6-8]。因此，Bcl-2和BAX蛋白间的表达关系决定了细胞的凋亡状态，若升高BAX /Bcl-2比值可促进细胞凋亡，而降低BAX / Bcl-2比值则抑制细胞凋亡。

BUN和Scr是传统临床病理学中检测肾功能最常用的指标。本研究显示，CRF大鼠血清BUN（18.63±2.67）、Scr（120.96±20.43）水平较高，大剂量益肾降浊冲剂灌胃治疗模型组大鼠2个月后BUN（14.23±1.76）、Scr（82.40±8.35） 含量有效降低，效果优于大黄素组大鼠血清BUN（16.33±1.95）、Scr（95.88±10.88）。且通过病理组织切片观察，其能够有效改善肾脏组织病变，提示益肾降浊冲剂对慢性肾衰大鼠肾组织有一定的保护作用。本研究结果进一步显示，模型组大鼠肾细胞凋亡数最高（911.40±91.81），经益肾降浊冲剂大剂量和大黄素治疗后细胞凋亡数均明显降低（266.60±59.50），（487.00±77.83）；且益肾降浊冲剂大剂量组凋亡数低于大黄素组（P＜0.05），说明益肾降浊冲剂大剂量治疗效果优于大黄素组。与正常组相比，CRF组肾组织中BAX表达显著增加（1157.40±123.31）、Bcl-2表达水平显著降低（157.60±38.66），而用大剂量益肾降浊冲剂和大黄素灌胃2月后CRF大鼠肾组织BAX 蛋白表达明显下降、Bcl-2蛋白表达明显增加，提示益肾降浊冲剂可能通过提升肾组织中Bcl-2的蛋白表达，同时下调肾组织中Bax的蛋白表达，从而使慢性肾衰进展得到减缓。本课题组前期研究表明，益肾降浊冲剂可改善线粒体结构和功能、减少自由基的产生、从而保护慢性肾功能衰竭大鼠肾脏。本研究结果进一步证明了，益肾降浊冲剂通过抑制氧自由基介导的线粒体凋亡信号通路，调节肾组织中BAX和Bcl-2（二者均为凋亡内在途径线粒体凋亡信号通路的关键调节因子）的蛋白表达从而达到减缓肾细胞凋亡，来到达改善肾衰大鼠肾组织病理、延缓肾衰进程的目的。

综上所述，益肾降浊冲剂可能通过改善线粒体呼吸功能、减少自由基的产生，抑制氧自由基介导的线粒体凋亡信号通路，从而保护慢性肾功能衰竭大鼠肾脏，延缓慢性肾衰的进程。