季铵型改性壳聚糖的制备及其在兔毛织物抗菌整理中的应用

2020-07-25张毅姜迎雪张昊

化工进展 2020年7期

张毅，姜迎雪，张昊

（天津工业大学纺织科学与工程学院，天津300387）

兔毛织物柔软舒适，与羊毛织物相比不遑多让，近年在市场逐步推广。兔毛织物产品加工几乎没有前处理，使得兔毛本身携带微生物及少量油脂；并且兔毛纤维鳞片层的排列与其本身为蛋白质纤维，为微生物的生长提供了有利条件，微生物生长繁殖使织物遭到损坏甚至危害人体健康，因此对兔毛织物进行抗菌整理具有重要意义。

壳聚糖是自然界中唯一带有氨基的生物高分子，壳聚糖溶解后的溶液中的氨基一般容易带上正电荷，通过与细菌细胞膜表面的负电子结合，改变细菌细胞膜的通透性可以起到抑制细菌生长的作用。这种天然生物高分子由于所具有的生物官能团性和相容性、安全性、微生物降解等优良性能，目前已被广泛应用于各领域，尤其在纺织领域应用广泛[1-8]。壳聚糖上裸露的氨基和羟基使壳聚糖具有活泼的化学性质，如果不对氨基加以保护就会导致氨基被取代。Wan 等[9]用苯甲醛与壳聚糖的活性氨基反应，将壳聚糖的氨基进行保护，制备得到N-苯亚甲基壳聚糖，再将其与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵反应得到中间体，然后进行水解，最终得到O-取代季铵化壳聚糖，但用醛类交联剂往往具有毒性，在使用过程中对环境有一定的污染，且脱保护的过程一般采用酸，可能导致壳聚糖分子量下降，影响抑菌性[10-11]。基于此本文采用甲壳素上的羟基与季铵化的化合物反应，再通过脱乙酰将活性氨基暴露，对反应位置有选择地进行改性，既在羟基上引入季铵基团，又保留C2上的氨基，最大程度上提高抑菌性能。季铵盐类抗菌高分子均属于阳离子型抗菌高分子，Kawabata等[12]研究认为阳离子杀菌剂的机理为：杀菌剂依靠静电作用，吸附到细菌带负电性的细胞膜，并且小分子的阳离子杀菌剂甚至通过细胞膜细胞壁进入细菌细胞内部，与细胞质相结合使其破裂，造成细菌释放出细胞的内容物，从而达到抑菌的目的。

值得一提的是，在现有的研究中大多采用三甲胺基季铵盐作为抑菌剂[13-14]，而三乙基季铵盐应用于织物抑菌整理的研究较少，三乙基由于推电子效应使N原子上的正电荷更加稳定，理论上较三甲胺基季铵盐有更强的阳离子性和抑菌性。基于此以三乙胺和环氧氯丙烷为原料，经化学反应合成3-氯-2-羟丙基三乙基氯化铵（CHPTAC-乙基）对甲壳素进行改性，然后经脱乙酰得到季铵化O-取代改性壳聚糖。本文研究了季铵型阳离子改性壳聚糖（CCTS）的抗菌活性，并将其应用于兔毛织物的抗菌整理。测试了整理前后兔毛织物的抗菌活性，探讨CCTS 在兔毛织物抗菌整理中的可行性和前景，为兔毛织物功能开发提供理论依据，对兔毛织物的推广有重要意义。

1 实验材料和方法

1.1 材料和仪器

材料：甲壳素，上海麦克林生化科技有限公司；三乙胺、盐酸、无水乙醇，天津风船化学试剂科技有限公司；环氧氯丙烷、四氯化碳、氢氧化钠、次磷酸钠、柠檬酸，天津科密欧化学试剂有限公司。用于研究的所有化学试剂，均为分析级。

仪器：IS50 型红外光谱仪，美国Nicolet 仪器公司；Varian Infinityplus 300 MHz 核磁频谱仪，美国Varian公司。

1.2 实验方法

1.2.1 季铵型阳离子改性壳聚糖（CCTS）的合成

醚化剂的合成：在装有电动搅拌、滴液漏斗和温度计的三口烧瓶中加入30mL 浓盐酸（36.5%），称取等摩尔质量的三乙基胺于滴液漏斗中，缓慢滴加。烧瓶置于30℃水浴，待反应完成后调节pH=8，水浴温度设为35℃，缓慢滴加环氧氯丙烷（环氧氯丙烷∶三乙胺=0.9mol∶1mol）反应4h。用四氯化碳萃取两次，加水旋蒸得到黏稠状液体CHPTAC-乙基。

季铵型甲壳素（CCT）的制备：在三口烧瓶中放入一定量的甲壳素、蒸馏水、NaOH，并不断搅拌，使pH=13，水浴温度控制在45℃，缓慢滴加CHPTAC-乙基（甲壳素∶CHPTAC-乙基=1mol∶0.6mol），反应4h，反应结束后用25%盐酸溶液调节pH=8，将三口烧瓶中的产物倒入烧杯中冷却至室温，向烧杯中加入等体积的无水乙醇并不断搅拌，静置沉淀。待产物完全沉淀后进行抽滤，用50%乙醇溶液进行洗涤，8000r/min 下离心10min,重复洗涤3次，然后置于真空干燥箱中进行干燥得到白色固体CCT。

CCTS 的制备：将一定量的蒸馏水倒入三口烧瓶中，加入适量的固体氢氧化钠和季铵型甲壳素，碱浓度50%，液固比15∶1，油浴140℃加热，磁力搅拌，密封，回流，脱乙酰化反应8h。停止加热和搅拌，抽滤。重复以上步骤，最后水洗至中性，置于50℃真空干燥箱中干燥得到较高脱乙酰度的CCTS。

1.2.2 兔毛织物的整理

将2g 整理剂、3g 柠檬酸和3g 次磷酸钠溶解于200mL 蒸馏水中，加入3g 兔毛织物，于50℃浸泡15min 后取出，压出多余液体，压液率控制在70%，重复进行两次。于80℃预烘5min，120℃焙烘2min，50℃水洗后再冷水洗涤，于50℃下烘干，得到经抗菌整理的织物。

1.3 季铵型壳聚糖的表征与测试

1.3.1 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

采用KBr 粉末压片法分析测试，使用Nicolet IS50 型红外光谱仪对样品进行FTIR 分析。称取10mg 试样与120mg 干燥的KBr 研磨均匀，用压片机制成样品压片，进行测试[15]。

1.3.2 核磁共振碳谱（13C NMR）

采用美国Varian 公司的Varian Infinityplus 300 MHz 核磁频谱仪对甲壳素、CCT、CCTS 进行13C NMR 谱分析。使用2.5mm 探针，扫描宽度250kHz，预扫描和驰豫延迟时间分别为10μs 和0.5s，自旋速率8.00kHz，扫描5h。

1.3.3 溶解性能的测定

以不同浓度柠檬酸溶液作溶剂配制1%的样品溶液，用紫外分光光度计在波长600nm下测定样品溶液的透射比[16-18]。

1.3.4 黏均分子量的测定

用乙酸作溶剂，采用黏度法对CCTS 分子量、壳聚糖分子量进行测定[19]。

1.3.5 最低抑菌浓度的测定

以0.5%醋酸溶液为溶剂配制0.5%的CCTS 溶液，将适量培养基与适量样品溶液混合制得浓度分别为0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L 的混合培养基，凝固后取1～2mL大肠杆菌菌悬液滴于平板中。

将接种好的平板放入培养箱，倒置培养24h。观察细菌的生长情况。完全抑制菌落生长的试液浓度为本样品对被试菌的最低有效抑菌浓度（MIC）值[20]。

称取0.2g样品溶解溶于40mL体积分数为0.5%的灭菌醋酸溶液中，同时将体积分数0.5%的灭菌醋酸溶液作为对照组。将19.2mL 培养基和0.8mL样品溶液（浓度为0.2g/L）同时加入平皿中，立即前后作用均匀摇晃平皿，使得样品液和培养基在培养基凝固前充分混合均匀，制得平皿，浓度为0.2g/L。凝固后取1～2mL大肠杆菌菌悬液(菌量约为106cfu/mL)滴于平板中。将接种好的平板放入培养箱，倒置培养24h，观察细菌的生长情况。

1.4 兔毛织物抗菌活性测定

试验采用GB/T 20944.3—2008对兔毛织物抗菌性能进行评价。

将0.75g±0.05g 织物与经过抗菌整理的织物分别装入盛有试验菌液的三角瓶中，在150r/min、37℃下接触震荡12h。取出，稀释到合适浓度，涂平板，于37℃生化培养箱中培养18h，分别观察空白组、对照组及试验组菌落生长情况。根据重复试验结果确定抗菌效果。细菌抑菌率按式(1)计算。

式中，R为细菌抑菌率，%；B、A为摇瓶前后活菌细胞数[21]。

2 结果与讨论

2.1 FTIR分析

图1 所示为CCTS 的制备原理，首先三乙胺与环氧氯丙烷发生亲核取代反应生成醚化剂，环氧基有较高的反应活性，与氨基葡萄糖环上的羟基发生反应生成醚键，将季铵基团引入到甲壳素分子上，得到CCT，再经脱乙酰得到CCTS。

图2 显示了醚化剂、甲壳素、CCT 和CCTS 的FTIR光谱。由图2(a)可知，在3400cm-1附近是与伸缩振动吸收峰的重叠，2970cm-1和2940cm-1处出现的是烷基中C H 键伸缩振动吸收峰，1470cm-1附近是CH2中C H 剪式振动吸收峰,1640cm-1附近出现的强峰是季铵盐的特征吸收峰，由此证明所得化合物应为目标产物CHPTAC-乙基。

由图2(b)可见，在1060cm-1附近的吸收峰对应甲壳素中的伯醇的伸缩振动，对应于1030cm-1处二烷基醚的吸收峰的增强[图2(c)]，可能是由于醚化剂与季铵型甲壳素分子形成醚键。图2(c)中1560cm-1和1630cm-1处的两个峰对应于季铵型甲壳素仲酰胺中NH 面内弯曲振动，1670cm-1处的峰对应于仲酰胺羰基的伸缩振动，其变为季铵型壳聚糖中的伯胺基团N H 键的面内弯曲振动，对应于图2(d)中1590cm-1和1620cm-1处的两个峰。因此，季铵基团通过与C6上的羟基形成醚键引入到甲壳素分子中，再经脱乙酰将C2上的乙酰胺基变为伯胺基得到CCTS。

2.2 13C NMR分析

图1 季铵型壳聚糖的制备

图3为甲壳素、季铵型甲壳素和季铵型壳聚糖的13C NMR 谱图。由图可见，在化学位移δ=104.5处的信号归属于甲壳素骨架的C1原子的特征峰，在δ=55～85 处的共振峰应归属为甲壳素C 圆环上C2～C6共振特征峰[22-24]，δ=174、23分别对应于甲壳素乙酰基中的sp2杂化碳原子即羰基碳原子的振动峰C7和最高场甲基中的饱和碳原子峰C8。

图3 甲壳素、季铵型甲壳素、季铵型壳聚糖的13C NMR谱图

经改性后甲壳素发生了显著变化，出现引入C链上的C9、C10、C11新特征峰，阳离子基团主链上的碳原子峰对应在δ=73.5 处出现的C9特征峰与C5比较接近，发生一定程度的重合，峰强度增强，同时出现了在季铵基团中与N原子连接两个烷基C原子的信号，在季铵基中随着N原子上烷基取代数量增多会使α 碳原子向低场移动至δ=54.5 处出现C12特征峰，它与C2、C11特征峰有一定程度的重合，信号增强，同时使与N原子相连的的β碳原子向高场移动至δ=9.5处出现C13特征峰，证实了甲壳素中引入季铵基团得到了CCT。

CCT 脱乙酰后低场sp2杂化C7峰与高场饱和甲基峰C8基本消失，乙酰基基本脱除，同时对季铵基团特征峰基本保留，强度未降低，说明脱乙酰过程对阳离子基团没有造成影响，证明最终得到CCTS。

2.3 溶解性能分析

由于壳聚糖是非热塑性材料，在受热熔化之前已经分解，因此壳聚糖产品的开发应用首先需要将其溶解制成溶液。然而壳聚糖大分子内存在较强的分子内和分子间氢键作用力，使得其在水和常见的有机溶剂中很难溶解，限制了壳聚糖的加工应用。因此改善壳聚糖的溶解性能，对于扩大和加强壳聚糖的应用具有十分重要的意义。

图4 不同柠檬酸浓度下季铵型壳聚糖与壳聚糖的透射比

试验通过对壳聚糖溶液的透光率分析来进行其溶解性能测试，溶解性能越好，透光率越大；反之，透光率越小。图4 显示了CCTS 与壳聚糖在随着柠檬酸溶液浓度的增大透射比也随之增强，在柠檬酸浓度为0.05mol/L 和0.1mol/L 时，CCTS 与壳聚糖的透射比基本无差别；而柠檬酸浓度在0.2mol/L时，由于大量羧基与氨基的结合，溶解性能增强，两者透射比显著增大，而CCTS 在壳聚糖分子链上引入阳离子季铵基团，离子基团同电子间相互排斥，由于空间位阻效应大分子间距提高，破坏了不同分子链基团间氢键作用，降低结晶度促进溶解，亲水基团数量增加，溶解性能显著提高；柠檬酸浓度增大到0.40mol/L，两者的透射比无显著提高。由此说明CCTS 在弱酸中的的溶解性优于壳聚糖，推测溶解性能的提高可能是CCTS 抑菌性能提高的因素。

2.4 黏度法测定分子量

图5为CCTS、壳聚糖黏度η与浓度C关系线性拟合曲线。使用外推法进行分子量计算，C 0 处即是特性黏度[η]，由[η]= KMα，即可推出样品的分子量。其中K 取1.81×10-3mL/g，α 取0.93[25]，计算可得样品的黏均分子量。

图5 季铵型壳聚糖、壳聚糖黏度与浓度关系线性拟合曲线（插图为黏均分子量）

由此得出CCTS 成功接枝上阳离子季铵基团，分子量增大。一方面CCTS 相当于壳聚糖上引入大分子量季铵基团；另一方面，溶解性能提高，有利于大分子充分扩散，导致相互纠缠，流动受阻，摩擦力增强，黏滞阻力增大，特性黏度增大导致分子量增大，同时有利于与纤维大分子和交联剂分子接触从而提高抑菌性和耐洗性。

2.5 CCTS的最低有效抑菌浓度

图6 中可以明显看出样品对大肠杆菌的促进、抑制以及细菌死亡的结果。甲壳素对大肠杆菌的生长无抑制作用，而季铵型甲壳素的MIC值为0.4g/L。经醚化剂改性后的甲壳素由于季铵基团提高了其溶解性能且碱性增强，对大肠杆菌的生长有一定的抑制作用。

图6 样品对大肠杆菌的抑菌率及菌落生长情况

壳聚糖、CCTS的MIC值分别为0.3g/L、0.2g/L。壳聚糖上的氨基具有一定的抑菌效果，带正电的自由氨基能与细胞壁上的负电荷结合，在细菌表面形成一层高分子保护膜阻止了营养物质向细菌内运输，而CCTS 含有的季铵基团比氨基碱性更强，抑菌性增强；且溶解性增强，分子量增大，所形成的保护膜更加致密，更能阻止细菌对外界营养物质的吸收，同时导致细胞壁形成孔洞而造成胞内成分外漏，从而导致细菌死亡。因此季铵基团的引入进一步增强了CCTS的抑菌性能。

2.6 兔毛织物的抗菌活性

兔毛纤维是一种蛋白质纤维，能够促进细菌生长，细菌的生长繁殖不仅会使织物遭到损坏甚至危害人体健康，因此对兔毛织物进行抗菌整理具有重要意义。

图7 不同整理剂对大肠杆菌的抑菌率

通过不同整理剂整理的兔毛织物对大肠杆菌抑菌效果的比较如图7所示，结果与上节抑菌率大致吻合，经脱乙酰后得到的CCTS 抑菌率达到99.9%以上。甲壳素溶解性差，整理过程中大部分沉积在兔毛纤维表面，抑菌性和耐洗性均不佳；甲壳素分子接枝上阳离子季铵基团，提高了亲水性能，但由于季铵型甲壳素上的活性基团较少，水溶性较差，与交联剂反应程度较小，大部分会涂覆在织物表面，在洗涤过程中会损失掉，抑菌性能表现不明显；而壳聚糖溶于弱酸，同时自身氨基具有一定的抑菌性能，壳聚糖分子上的氨基、羟基与柠檬酸上的羧基反应生成酰胺键和酯键从而交联到兔毛纤维上，具有较好的耐洗性；CCTS 溶解性能提高且含有更强的抑菌基团，更容易发生交联反应，因此耐洗性和抑菌性能最佳。

在此基础上，针对CCTS 整理的兔毛织物进行抗菌试验结果如图8所示。经过多次洗涤后兔毛织物抑菌效果依旧保持稳定，这表明CCTS 是一种长效优异的毛织物抗菌整理剂。