绿色木霉前发酵工艺提高苹果渣水溶性膳食纤维研究

朱 妞

(西安医学院 公共卫生学院，西安 710021)

膳食纤维(DF)具有降低胆固醇、控制血糖、改善肠道功能紊乱、控制体重等一系列生理功能，对于人类健康有积极的预防作用[1-3]。全民健康是全民小康的重要前提，全民营养是全民健康的保证。膳食纤维作为第七营养素，是居民每日膳食中重要的营养素，在食品工业中占据重要的地位，可以广泛应用于主食、肉制品、保健品、乳制品、饮料、保健食品、调味品、婴幼儿食品等各个领域[4,5]。DF包含水溶性膳食纤维(SDF)和水不溶性膳食纤维(IDF)。二者的比例对膳食纤维的理化特性和生理功能影响较大[6,7]，SDF主要体现在控制血糖、降低胆固醇等代谢功能方面，IDF则通过一定的机械蠕动改善肠道功能。具有应用价值的DF应该至少含有10%以上的SDF[8]。我国的苹果资源丰富，年产量大，陕西省是苹果资源大省[9]。苹果汁加工产生的废弃物苹果渣中含有丰富的膳食纤维，但是SDF不足，只占3%左右。通过微生物发酵改善苹果渣膳食纤维的组成，提高SDF含量，才能更好体现膳食纤维的代谢功能特性[10]，真正变废为宝，提升苹果产业链附加值。

微生物发酵制备膳食纤维主要是利用菌种产生的纤维素酶分解纤维，提高SDF含量，目前主要采用的菌种是曲霉属和木霉属[11]。绿色木霉对人体无毒性，产纤维素酶活性非常高，降解效果好，且菌体繁殖快，被广泛应用于食品发酵[12]。本试验设计了绿色木霉前发酵和后发酵工艺处理苹果渣膳食纤维。通过前发酵，绿色木霉在适宜的条件下培养，产生大量的生物酶；后发酵过程利用绿色木霉产生的生物酶酶解，改善苹果渣膳食纤维组成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果渣：由渭南海升果业有限公司提供，清洗干燥后粉碎过40目筛；绿色木霉：沂源康源生物科技有限公司；磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、氯化钙：分析纯，西安化学试剂公司；琼脂、葡萄糖：市售。

1.2 仪器与设备

玻璃仪器：锥形瓶、离心管、量筒、试管等。

QE-200型万能粉碎机 江阴市万通药化机械设备有限公司；HH2-型恒温水浴锅 北京化玻联医疗器械有限公司；pHS-3C型精密pH计 上海大中分析仪器有限公司；JA5003型电子天平 上海精密科学仪器厂；WJ-2型电热恒温培养箱 上海和呈仪器制造有限公司；80001-10070型全温型恒温培养摇床 上海茸研仪器有限公司；JHT-DD型工作台 上海树立仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵剂制备

活化培养基采用马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，自然pH，加蒸馏水1 L，制成马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板；发酵培养基：苹果渣原粉，磷酸二氢钾6.5 g，硫酸铵6 g，硫酸镁2.5 g，氯化钙1.5 g，加蒸馏水1 L；发酵剂：在 PDA培养基中接种绿色木霉菌种，28 ℃条件下培养72 h。用无菌水洗下孢子，并震荡稀释。采用血球计数板计数，孢子含量在107～108CFU/mL[13]。

1.3.2 绿色木霉发酵制备苹果渣膳食纤维

将一定量苹果渣粉加水调制混匀后，装入锥形瓶中，于121 ℃条件下灭菌处理20 min，迅速冷却。按照试验需要接入不同体积的发酵液，维持试验设计条件进行前发酵培养。后发酵：调节pH为5.0，温度50 ℃，继续发酵48 h。前后二次发酵结束后加入95%乙醇进行醇沉后将滤渣烘干，粉碎过80目筛，即为苹果渣膳食纤维粉。

前发酵工艺条件的确定，主要采用单因素试验和正交试验。考察料液比、发酵初始pH、接种量、培养温度、培养时间等因素对SDF含量的影响，设计正交试验确定最佳前发酵工艺参数。

1.3.3 膳食纤维计算方法

本试验膳食纤维总含量和水溶性膳食纤维含量的测定采用酶-重量法[14]。

SDF含量=水溶性膳食纤维质量/总膳食纤维质量×100%。

(1)

1.3.4 膳食纤维持水力和膨胀力的测定方法

准确称取1.0 g膳食纤维粉于100 mL烧杯中，加入50 mL蒸馏水，振摇，混匀后放置于25 ℃水浴1 h。使苹果渣膳食纤维充分吸水后过滤沥干，而后转移到表面皿，称重，采用公式(2)计算膳食纤维的持水力(g/g)。

(2)

准确称取1.0 g膳食纤维粉于100 mL量筒中，加入50 mL蒸馏水，振摇，混匀后置于室温条件，静置24 h。采用公式(3)计算膳食纤维的膨胀力(mL/g)。

(3)

2 结果与分析

2.1 料液比的影响

准确称取5.0 g苹果渣粉于250 mL锥形瓶中，按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)加入相应的培养基，混合均匀，调节pH为6.0，接种8%绿色木霉发酵剂，32 ℃条件下发酵2 d。测定水溶性膳食纤维和总膳食纤维，计算SDF含量，结果见图1。

图1 料液比对SDF含量的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on SDF content

由图1可知，料液比会对绿色木霉的繁殖产生一定的影响。料液比较小时，培养基中水分含量少，苹果渣与绿色木霉接触不充分，发酵效果不理想。料液比为1∶20时，绿色木霉获得充足的水分，和苹果渣发酵作用较为充分，产生充足的菌丝和酶，发酵效果较佳。随着料液比的增加，过多的水分会减少发酵体系的氧气，反而不利于绿色木霉菌体生长，同时也加大了后续处理的难度。

2.2 培养温度的影响

准确称取5.0 g苹果渣粉，加入100 mL培养基，调节pH为6.0，接种8%绿色木霉发酵剂，在28，30，32，34，36 ℃的温度下培养菌种2 d，计算SDF含量，结果见图2。

图2 培养温度对SDF含量的影响Fig.2 Effect of culture temperature on SDF content

由图2可知，适宜的温度对绿色木霉的繁殖和发酵非常重要。32 ℃最适宜绿色木霉的繁殖，SDF含量达到最大值。温度是影响微生物繁殖的重要因素，也影响酶的活性和各种生化反应的进行。温度较低会抑制绿色木霉代谢产酶等活性，过高的温度会减缓绿色木霉生长，减少酶的产生，SDF含量显著降低。参考其他研究成果，绿色木霉适宜的温度均在32 ℃左右，与该结论基本一致，因此后续试验选择最佳绿色木霉培养温度为32 ℃。

2.3 发酵液初始pH的影响

准确称取5.0 g苹果渣粉，加入100 mL培养基，接种8%发酵剂，调节发酵液初始pH分别为5.7，6.0，6.3，6.6，6.9，于32 ℃条件下培养2 d，计算SDF含量，结果见图3。

图3 发酵液初始pH对SDF含量的影响Fig.3 Effect of initial pH value of fermentation broth on SDF content

由图3可知，发酵液初始pH为6.0时，SDF含量达到最大值24.51%。之后随着pH的增加，SDF含量不断下降。一般而言，真菌适合在弱酸性条件下生存，偏酸性环境更加有利于绿色木霉的繁殖。

2.4 绿色木霉接种量的影响

准确称取5.0 g苹果渣粉，加入100 mL培养基，调节发酵液初始pH 为6.0，分别接种6%、8%、10%、12%、15%绿色木霉，在32 ℃条件下培养2 d，计算SDF含量，结果见图4。

图4 绿色木霉接种量对SDF含量的影响Fig.4 Effect of inoculation amount of Trichodermaviride on SDF content

由图4可知，随着绿色木霉接种量的增加，SDF含量呈现一定的上升趋势。随着接种量的增加，培养基中绿色木霉比例增加，产生更丰富的酶，发酵效果有所提升。底物浓度一定的情况下，接种量的进一步增加会导致营养物质不够，继而受到限制。因此，后续增加接种量，SDF含量增加不明显，反而因为竞争性导致产酶力受到限制，SDF含量有下降趋势。

2.5 培养时间的影响

准确称取5.0 g苹果渣粉，加入100 mL培养基，调节发酵液初始pH 为6.0，接种8%绿色木霉发酵剂， 在32 ℃条件下分别培养40，48，56，64，72 h，计算SDF含量，结果见图5。

图5 培养时间对SDF含量的影响Fig.5 Effect of culture time on SDF content

由图5可知，随着培养时间的延长，SDF含量整体呈现上升的趋势。主要原因是菌种进入培养基后繁殖有一定的滞后性，随着时间延长至64 h时，绿色木霉产酶活力最强，进入对数生长期，产生最大量的各种酶类。在后发酵阶段，这些酶与苹果渣膳食纤维充分作用，提高了SDF含量。时间继续延长，积累的一些生化反应产物反而影响水溶性膳食纤维的含量。

2.6 正交试验

按照表1进行四因素三水平正交试验设计，在培养温度为32 ℃的条件下，考察前发酵过程料液比、发酵液初始pH、绿色木霉接种量、培养时间4个因素对SDF含量的影响。后发酵工艺条件同上，保持不变。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

按照试验设计，完成9组试验，计算相应的SDF含量，正交试验结果分析见表2。

表2 L9(34)正交试验结果分析表Table 2 Analysis of L9(34) orthogonal test results

由表2的正交试验结果可知，因素影响的主次顺序为D>B>C>A，培养时间对绿色木霉的生长、产酶影响最大，64 h为菌种对数生长期，对后发酵提供的酶最为充足，SDF含量显著增加。由K值可以得出优组合为A1B2C2D2，即料液比1∶15(g/mL)，发酵液初始pH 6.0，绿色木霉接种量10%，培养时间64 h。此组合为试验序号2，在此条件下平行试验3次，取平均值，膳食纤维总得率为79.8%，SDF含量为30.27%，该膳食纤维的持水力为7.54 g/g，膨胀力为8.62 mL/g，比原苹果渣粉(持水力2.19 g/g，膨胀力2.87 mL/g)有了很大提升。

2.7 发酵前后苹果渣膳食纤维结构对照

将苹果渣原粉和通过绿色木霉二次发酵所得的改性膳食纤维产品通过电镜扫描，比较二者结构的改变，结果见图6。

图6 苹果渣发酵前后扫描电镜图Fig.6 Scanning electron micrograph of apple pomace before and after fermentation

由图6对比发现，苹果渣原粉的颗粒较大，表面光滑规整，形状规则，几乎呈现圆球形。通过绿色木霉二次发酵后，膳食纤维表面粗糙，更加细腻，呈现蜂窝状。结合SDF含量的增加，分析原因可能是通过发酵改性使苹果渣膳食纤维结构更加疏松，水溶性增加，体现一定的立体结构，从而表现出更好的持水力和膨胀力。

3 小结

采用绿色木霉前发酵和后发酵二次发酵工艺对苹果渣进行发酵处理，极大地提高了苹果渣膳食纤维的SDF含量，总膳食纤维得率达79.8%，水溶性膳食纤维(SDF)含量可达到30.27%。此类研究报道很少，通过试验发现对绿色木霉二次发酵对苹果渣SDF含量的提升效果较佳。

通过单因素试验和正交试验对绿色木霉前发酵工艺进行研究，得出最佳工艺条件为：培养温度32 ℃、料液比1∶15(g/mL)、发酵液初始pH 6.0、接种量10%、培养时间64 h，后发酵条件为发酵温度50 ℃、pH 5.0、发酵时间48 h条件不变。后续可以进一步研究后发酵工艺条件，寻找微生物发酵制备膳食纤维的优化工艺路线。

绿色木霉二次发酵制备的苹果渣膳食纤维持水力为7.54 g/g，膨胀力为8.62 mL/g，比原苹果渣粉性能有了很大提升，后续应对改性膳食纤维粉进行理化特性全面分析，为改性膳食纤维在食品工业中的应用提供了参考依据。