姜黄素对肺癌A549细胞迁移和侵袭的影响

谭 丹 曾小琴 徐 伟 陈 戬 周人杰

非小细胞肺癌占肺癌总数的75%～85%，其特征是极易发生侵袭和转移[1-2]。大部分患者在发现时已失去手术机会，因此深入探讨肺癌侵袭转移机制，可为非手术治疗提供一些线索[3-5]。近几年来研究发现姜黄素(Curcumin)是一种天然多酚类色素，能抗炎、抗微生物等，药理作用丰富，在抑制肿瘤细胞增殖、侵袭方面也有着显著成效[6-23]。本文观察浓度梯度的姜黄素对肺癌A549细胞侵袭迁移能力的影响，以及对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、E型钙黏蛋白(E-cadherin)以及N型钙黏蛋白(N-cadherin)的表达影响，从而探索A549细胞侵袭、迁移的机制，为临床上肺癌的治疗提供线索。

材料与方法

一、实验材料

姜黄素购自广州盛德生物公司(粉剂，95%纯度)。EGFR、E-cadherin、N-cadherin抗体购自英国Abcam公司。0.25%胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM培养基(高糖型)均购自美国Hyclone公司。细胞培养板、Transwell小室、基质胶购自BD公司。人肺癌A549细胞株和人正常肺上皮细胞由陆军(第三)军医大学第二附属医院提供。

二、实验方法

1.台盼蓝染色：取5×104个正常人肺上皮细胞接种于6孔板中，孵箱中培养过夜。加入浓度0，10，20，40，80 μg/ml的姜黄素(其中0 μg/ml为对照组)继续培养48 h。提取细胞悬液，加入台盼蓝溶液以9︰1的比例混匀着色，各组细胞悬液计数板计数，显微镜下计数死细胞与活细胞数，计算不同药物浓度下细胞病死率。

2.MTT实验：取1×104/ml 的A549接种于96孔板中，每孔约3×103个细胞，放置于孵箱中培养。加入姜黄素溶液100 μl，终浓度分别为0、10、20、40、80 μg/ml，(其中0 μg/ml为对照组)，每组设5个平行孔，放入孵箱中继续培养。于48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h，去上清液，加入DMSO振荡溶解10 min，酶标仪测570 nm处吸光度，计算增殖率，再算出半数抑制浓度(IC50)。

3.划痕实验：取对数生长期的A549细胞重悬、均匀等量接种于6孔板上，孵箱培养铺满细胞，去上清，选择细胞密度相当的4处，用10 μl 的枪头作划痕，各孔分别加入含0、10、20、40 μg/ml 姜黄素的DMEM培养液继续培养，记录划痕宽度并计算每孔平均值，最后计算平均划痕愈合率。

4.Transwell实验：本实验采用8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室。将生长良好的A549细胞重悬计数，以5×104个接种于上室基质胶上，并在各上室中分别加入含0、10、20、40 μg/ml 姜黄素培养液200 μl，下室加含FBS的DMEM培养液700 μl，培养24 h后，用4%多聚甲醛固定上室外面细胞，用0.05结晶紫溶液染色30 min，PBS洗3次，用倒置显微镜(10×10)倍视野下，各上室随机选取5个视野观察穿过膜的细胞，照相并计数，取其平均值进行统计分析。

5.Werstern blot实验：用0、10、20、40 μg/ml姜黄素处理各组细胞后，悬浮并收集细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS洗2次，弃上液，加入细胞裂解液冰上裂解10 min，1 000 r/min离心10 min，收集上清液并测定蛋白量。配置电泳凝胶，等量上样，蛋白质电泳分离，凝胶电泳后转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗封孵育过夜后复温2 h，TBST洗膜后放入二抗中孵育2 h，洗膜后暗室胶片发光、显影、定影，最后扫描并记录。用Quantity One 软件进行灰度值分析，用目的蛋白的灰度值与B-actin的灰度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

三、统计学方法

结 果

一、姜黄素对正常肺上皮细胞的不良反应结果

姜黄素浓度在0～40 μg/ml时细胞病死率<10%，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，可见姜黄素对正常肺上皮细胞毒性小，见图1。

图1 姜黄素对人正常肺上皮细胞病死率的影响；注：*P<0.01，与对照组比较

二、姜黄素对A549细胞增殖有抑制作用

MTT法显示姜黄素浓度升高细胞悬液分光光度值(A570值)越低，与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明姜黄素抑制A549细胞增殖呈浓度依赖，见表1、图2。

表1 姜黄素对A549细胞增殖的影响

图2 姜黄素对A549细胞增殖的影响；注：*P<0.05，#P<0.01，与对照组比较

三、姜黄素对A549细胞迁移力的抑制

与对照组相比，不同质量浓度的姜黄素作用于A549细胞12 h和24 h后，对肺癌细胞的迁移愈合能力有抑制作用(P<0.01)，且呈药物浓度依赖性(P<0.01)，见图3。

图3 A549细胞划痕实验光镜照片(HE×100)；注：*P<0.01，与对照组比较；#P<0.01，与较低剂量组比较

四、姜黄素对A549细胞侵袭力的抑制

Transwell实验显示，与对照组相比，不同浓度姜黄素作用A549细胞后，细胞在体外穿透模数量(侵袭力)有明显的减少(P<0.01)，且呈浓度依赖性(P<0.01)，见图4。

图4 A549细胞Transwell侵袭实验光镜照片(HE×100)；注：*P<0.01，与对照组比较；#P<0.01，与较10 μg剂量组比较

五、Werstern blot检测EGFR、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达

Werstern blot检测结果显示姜黄素抑制A549细胞中EGFR及N-cadherin蛋白表达(P<0.05)，同时能上调E-cadherin蛋白的表达，其作用均呈剂量依赖性(P<0.05)，见图5。

图5 Western blot显示各组中EGFR、E-cadherin以及N-cadher蛋白的表达变化注：*P<0.01 vs.1; #P<0.01 vs 2; ∧P<0.01 vs.3

讨 论

近年来肺癌跃居肿瘤排名的首位，许多患者发现晚，已失去手术机会。放化疗不仅不良反应大，且对于非小细胞肺癌作用十分有限。而靶向药物受众小，且基因突变检出率有限，肺癌患者5年生存率低，预后差，远处转移发生频繁[24-26]。是否有一种价格低廉受众广泛的方法能够有效控制肺癌？也许从肺癌侵袭转移的机制入手，可以找到有效的治疗方法。姜黄素是从植物姜黄的根茎提取的一种有效的广谱抗肿瘤成分，在结直肠肿瘤、泌尿系统以及生殖系统肿瘤均有研究，研究表明姜黄素对肺癌也有抑制作用，是通过上调Bax、Caspase-3表达，下调Bcl-2表达，从而使细胞线粒体外膜孔道开放，诱导凋亡[27-30]。本文MTT实验也说明姜黄素抑制A549细胞增殖，应证了这一理论，这一理论仅能解释A549细胞增殖的抑制，却不能很好的解释对侵袭和迁移能力的影响，本文在划痕实验和Transwell实验中证明了姜黄素对A549细胞侵袭和迁移能力的抑制，且对EGFR、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达有调节作用。

上皮细胞间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞在各种因子调控下，细胞间紧密连接消失，失去细胞极性，从而获得游走能力，具有了间质细胞的特性，能在脉管及组织间隙移动，这种上皮细胞失去连接分化，向间质细胞变化的过程叫做上皮间转[11]。而肿瘤细胞的侵袭迁移能力就与这种失黏附的转变有密切关系，分子表型主要表现为上皮细胞标志蛋白如E-cadherin蛋白的表达降低，间质细胞相关N-cadherin蛋白表达的增加[10]。头颈部肿瘤、卵巢癌、乳腺癌等发生侵袭转移都与上皮间转EMT有着密切关系，且逆转EMT后，肿瘤细胞的侵袭迁移能力下降显著[24-26]。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种跨膜黏蛋白，是原癌基因CerbB-1的表达产物。在健康人肺组织中EGFR低表达，而在大多数非小细胞肺癌患者肿瘤组织中存在高表达情况[8-9]。且在有淋巴转移和神经侵犯的患者组中EGFR的表达明显高于淋巴、神经侵犯阴性的患者组[10]。EGFR能与胞外配体结合，激活多条亚细胞通路，不仅能参与细胞的生长增殖，也使癌细胞产生动员效应，发生肺癌的转移。因此EGFR的过度表达与肺癌的发生、发展有着密切的关系。

综上所述，姜黄素(Curcumin)是一种天然多酚，植物药成分具有来源广泛，价格低廉，不良反应小的特点，为该种成分走向临床提供了很好的先决条件[16]。目前在医学多领域对此成分都有深入研究，并且在抗肿瘤方面已有研究显示姜黄素对结直肠肿瘤、泌尿生殖肿瘤有抑制作用，还能抑制皮肤癌、口腔癌等多种肿瘤细胞的侵袭迁移能力，并且诱导多种肿瘤细胞凋亡[17-18,31-32]。但在抑制肿瘤侵袭迁移方面机制的研究还没有十分明确。本文发现在一定浓度范围内对正常肺上皮细胞的细胞毒性作用小，而通过肺癌A549细胞作体外实验发现姜黄素对肺癌A549细胞有抑制增殖的作用，可见姜黄素不是通过细胞毒作用无差别杀伤肿瘤和肺肿瘤细胞，并且姜黄素能明显抑制A549细胞的侵袭和迁移能力，且呈药物浓度依赖关系。药物处理后EGFR、E-cadherin蛋白的上调，N-cadherin蛋白的下调，则提示其机制可能是通过抑制EGFR蛋白的表达及逆转EMT的发生而发挥作用。