基质蛋白酶-10 在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

彭根远， 周 洁， 陈 托， 李 海， 巩发海， 孙书豪

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院结直肠外科，银川 750004）

结直肠癌是常见癌症之一，全球每年死亡例数超过693900 例[1]。是中国排名第四位的恶性肿瘤，且发病率有逐年上升趋势[2]。自20 世纪90 年代人们发现基质金属蛋白酶类（MMPs）能促进肿瘤组织的血管生成，促使肿瘤组织的生长和转移，激发了研究者们对MMPs 研究的兴趣[3-4]。研究发现结直肠癌症患者血清表达MMP-10 者常预后不良[5]，有学者研究消化道肿瘤发现MMP-10能够通过调控钙离子通道促进消化道肿瘤的发展[6]，肿瘤细胞通过分泌各种酶类降解细胞外基质，向周围及远处组织侵袭转移，促进肿瘤微血管生成，其中最重要的是基质金属蛋白酶类[7]。推测MMP-10 可能参与了结直肠癌的进展和转移。本实验通过Western blot 和实时荧光定量PCR（qPCR）及免疫组织化学染色方法检测结直肠癌、癌旁以及正常结直肠组织中MMP-10 蛋白及mRNA 的表达情况，并研究其与患者临床病理特征的关系，分析MMP-10 在结直肠癌中的可能作用及临床意义。

1 材料和方法

1.1 临床资料

标本组织源于 2018 年3—12 月宁夏医科大学总医院结直肠外科手术获取的结肠癌或直肠癌组织40 例和相对应的癌旁组织（距离癌组织中心≥4 cm）以及相对正常的结肠或直肠组织（距离癌组织中心≥8 cm 或大肠癌标本切口缘最远端）标本；所有患者术后均由宁夏医科大学总医院病理科确诊为结直肠癌。所有患者术前均未进行放疗、化疗，年龄 43～83 岁，平均（61.37±11.45）岁；男 22 例、女 18 例；直肠癌 26 例、结肠癌 14 例。

1.2 主要试剂和仪器

全蛋白提取试剂盒（凯基生物）、5×SDSPAGE 蛋白上样缓冲液（凯基生物）、BCA 蛋白含量测试试剂盒（凯基生物）、彩色蛋白Marker（凯基生物）、PVDF 膜（ImmobilonRTransfer Membranes）；Trizol（Invitrogen 公司）、反转录 cDNA试剂盒（Thermo Fisher，货号 00118088）、SYBRR Select Master Mix（Thermo Fisher，货号 4472908）；兔抗人MMP-10 多克隆抗体（abcam，货号ab38930）、内参兔抗β-actin（abcam，货号ab8227）兔二步法检测试剂盒（北京中杉金桥，货号P6001）、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥）；正置荧光显微镜（Leica）、NICON 图像采集系统（日本 NICON）、Bio-rad IQ5 qPCR 仪器等。

1.3 Western blot 测定结直肠组织中MMP-10 蛋白的表达

分别研磨结直肠癌、癌旁、正常组织后加入全蛋白提取试剂，充分裂解后1200 r·min-1离心10 min，取上清，用BCA 蛋白含量测试试剂盒（凯基生物）测其浓度，按1∶4 的比例加入蛋白上清缓冲液，100℃加热5 min，存放于-20℃待用。现配10%的SDS-PAGE 胶，按浓度加样，80V 电压15 min，120 V 电压 90 min，取胶 100 V 电压转膜90 min，取膜，TBST 缓冲液冲洗 1 次，5%的脱脂牛奶封闭 90 min，TBST 冲洗 3 次，每次 10 min，在浓度为4000∶1 的一抗工作液中 4℃孵育过夜，TBST缓冲液冲洗3 次，每次10min，室温孵育二抗（2000∶1）90 min，TBST 缓冲液冲洗 3 次，每次10 min，加入适宜的ECL 显色液反应1 min后在凝胶成像系统曝光，拷贝曝光的条带。重复3 次实验，将扫描后的图片用Image J 图像分析软件对结果进行定量分析，采用目的条带均值灰度值（IOD）/内参条带均值IOD 表示目的蛋白的相对表达量。并使用GraphPad 6.0 软件统计作图。

1.4 qPCR 测定结直肠组织中MMP-10 mRNA的表达

分别研磨结直肠癌、癌旁和正常组织后加入Trizol 裂解液充分裂解，氯仿分离RNA，等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，弃上清液，75%乙醇清洗2 次RNA 沉淀，混匀后离心，加入适量DEPC 水溶解沉淀。然后酶标仪检测260 和280 nm波长处的光密度（OD）值，测定RNA 溶液浓度和纯度。12 μL 体系加样后在Bio-Rad PCR 仪器上机（65℃加热 5 min，冰浴），20 μL 体系 Bio-Rad PCR 仪器上机（42℃加热 60 min，70℃加热 5min）合成cDNA。其中MMP-10 引物：上游5'TTTGGCTCATGCCTACCCAC3'；下游 5'TCTTGCGAAAGGGC GGAACTG3'；内参 GADPH 引物：5'ACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG3'，5'GTCAAAGGTGGAG GAGTGGGT3'。参照 SYBRRSelect Master Mix 说明书20 μL 体系加样，重复加样2 个孔，以GAPDH为内参，在Bio-rad IQ5 qPCR 仪器上检测［95℃预变性 2 min，95 ℃变性 10 s，58℃退火 32 s、72 ℃延伸 30 s，95 ℃ 60 s、95 ℃ 60 s、55 ℃～98 ℃（10 s/cycle 0.5 ℃/cycle）86 cycles］，导出excel 表格数据，采用 2-△△Ct计算结果：△△Ct=癌组（Ct-Ct空白）/癌旁组（Ct-Ct空白）-正常组（Ct-Ct空白）。并使用GraphPad 6.0 软件统计作图。

1.5 免疫组织化学法（IHC）测定结直肠组织中MMP-10 表达

分别将结直肠癌、癌旁、正常组织石蜡包埋固定，切片，烤片3 h 后进行透明、脱水，柠檬酸盐高压修复后3% H2O2室温孵育消除内源性过氧化物酶的活性，10%正常山羊血清封闭后滴加一抗 MMP-10（1∶300）工作液，4 ℃下孵育过夜，抗兔二抗孵育1 h，苏木素染色、盐酸酒精分化、清水反蓝，脱水、二甲苯透明后中性树胶封片，于Leica 正置显微镜下观察并拍照。所得结果由病理科医师在100 倍镜下随机观察10 个视野进行判定。根据着色强度和阳性细胞数分别计分后，按这2 项计分之和得最终结果，两项指标值相加总评分≥4 分的为MMP-10 蛋白表达阳性，＜4 分则为MMP-10 蛋白表达阴性。其染色强度可分为：阴性（-）：无染色，0 分；弱（+）：淡黄色，1 分；中（++）：棕黄色，2 分；强（+++）：棕褐色，3 分。IHC 染色后细胞数评分标准：染色细胞数所占同类型细胞数的百分比＜30%的为1 分；30%～60%为 2 分；＞60%为 3 分。使用 GraphPad 6.0 软件统计作图。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用例或率（%）表示，各组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 相关分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠正常组织、癌旁组织、癌组织中MMP-10 蛋白的表达情况

Western blot 检测结果发现，在结直肠癌旁组织、癌组织中MMP-10 蛋白表达水平均高于结直肠正常组织（P 均＜0.05），同样癌组织中MMP-10 mRNA 及其蛋白表达水平均高于癌旁组织（P 均＜0.05）。见图 1。

2.2 结直肠癌患者肠组织中MMP-10 阳性表达情况

IHC 实验结果显示：40 例正常组织中MMP-10阳性为3 例（7.5%），40 例癌组织中为25 例（62.5%），40 例癌旁组织中为16 例（40.0%），癌组织的阳性表达率高于癌旁组织（χ2=25.593，P=0.000），癌旁组织的阳性表达率高于正常组织（χ2=11.665，P=0.001）。结直肠癌组织中MMP-10 主要表达在细胞质中，并且可向细胞外分泌，染色为棕褐色，呈中等或强阳性表达，而癌旁组织及正常组织中MMP-10 呈弱阳性或阴性表达。见图2。

2.3 MMP-10 与结直肠癌患者不同临床病理指标的相关性分析

以免疫组化结果进行相关性分析发现：MMP-10 的表达与结直肠癌的分化程度呈负相关（r=-0.343，P＜0.05）、与 TNM 分期成正相关（r=0.412，P＜0.05）、与转移呈正相关（r=0.529，P＜0.05）。MMP-10 与临床病理特征间的关系显示，在结直肠癌分化程度、TNM 分期（T1～T2、T3～T4、N0～N1、N2～N3）、临床分期（Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期比较）、转移与否进行比较差异均有统计学意义（P 均<0.05）；患者的年龄、性别、病理学类型、肿瘤大小、部位比较差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。见表1。

表1 MMP-10 与结直肠癌患者的临床病理的关系（例）

2.4 结直肠癌患者不同部位的组织中MMP-10 mRNA 表达情况

qPCR 检测结果显示：癌组织中 MMP-10 mRNA 相对表达量高于癌旁组织（P<0.05），癌旁组织中的MMP-10 mRNA 相对表达量高于正常组织（P<0.05）。见图 3。

3 讨论

在美国，结直肠癌是癌症死亡的第三大原因[8]。MMP 蛋白酶家族参与细胞外基质的降解，可促进癌细胞的侵袭和转移[9]。基质金属蛋白酶是一组Zn2+、Ca2+依赖的内源性蛋白水解酶家族，可由成纤维细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞合成和分泌，能降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分和一些非基质蛋白，多种肿瘤组织中有MMPs 表达，参与肿瘤进展、血管生成、周围组织侵袭和转移灶的形成，并逃避免疫系统。众所周知，目前已有26 种MMPs 成员被发现。

对基底细胞癌（BCC）和鳞状细胞癌（SCC）活检标本的研究发现，MMP-10 在肿瘤上皮和间质细胞中呈高表达，并且随鳞癌级别的增高MMP-10 的表达也增高[10]。同样在食管癌[11-13]、胃癌[14]、肝细胞癌[15]、宫颈癌卵巢癌[16-17]中也发现MMP-10 的高表达，支持MMP-10 在人类肿瘤进展中的作用。Tiwari 等[18]研究发现，相对于正常人体中，大肠癌患者血清中MMP-7、MMP-10、MMP-12 的表达更高，且表达水平与总体存活率呈负相关。MMP-10 主要通过调节癌细胞的增殖迁移能力[12，19]、血管增生[20]，细胞凋亡[16，21-22]这三个途径影响癌症的发生发展。实体癌侵入周围组织的主要步骤之一是细胞外基质中组织屏障的降解，血管生成和癌细胞转移，主要是由于基质金属蛋白酶（MMP）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）之间的动态平衡破坏[22]。在人口腔鳞状细胞癌中，TGF-β1 诱导的HSC-4 细胞侵袭性受到MMP-10 小干扰 RNA（si RNA）的抑制[23]。在食管鳞状细胞癌（ESCC）中将AJUBA 鉴定为推定的癌症基因，使用RNA 测序揭示涉及的AJUBA 的致癌途径，发现AJUBA 是通过激活ERK1/2 来上调MMP10 和 MMP13 的水平[4]。

本研究结果显示，在结直肠癌患者的癌组织、癌旁组织、正常组织中MMP-10 蛋白的表达水平差异有统计学意义，呈依次降低趋势。MMP-10 作为参加结直肠癌发生发展的重要因子，其可能通过TGFβ-1 参与调控EMT 通路促进细胞的增殖和侵袭，同时MMP-10 也受VEGF 的调控，在MMPs之间，MMP-10 促使 MMP-9 和 MMP-2 的分泌，推测MMP-10 可能受VEGF 调控，影响MMP-9和MMP-2，调节血管的增生，促进癌细胞的转移。本研究着眼在结直肠癌患者组织中MMP-10 蛋白的表达来验证其与结直肠癌的关系，重点阐明MMP-10 与结直肠癌发生发展的相关性，为进一步研究其在结直肠癌发生和转移机制中的作用。在结直肠癌中，MMP-10 的具体作用机制尚无明确定论，需要我们进一步深入研究证明。

综上表明，MMP-10 可能有促进结直肠癌的发生发展的作用，甚有可能成为肿瘤免疫预防和治疗提供一个新方向、新思路，其具体的临床应用仍有待进一步的探讨。