Mex3c 参与调控小鼠下丘脑Arc、VMH 神经核团C-FOS表达的作用

霍 泉， 孙东君， 李 婷， 孙 婷， 杜 勇

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院生物样本库，银川 750004； 3.宁夏医科大学总医院小儿外科，银川 750004）

秀丽隐杆线虫肌肉表达物3（Mex3c）是从线虫到人类的保守RNA 结合蛋白，是一种含有hnRNPK 同源的（KH）RNA 结合结构域的 RNA 结合蛋白[1]，其含有E3 泛素连接酶，参与调控pal-1，rme-2 和 nos-2 等靶 RNA，相关研究报道[2-5]，Mex3c 基因可导致遗传易感的高血压病、控制恶性肿瘤中RNA 的不稳定性、通过促进能量消耗，减少机体脂肪的堆积。课题组前期研究[6]发现，Mex3c 在突变的小鼠体内表现出强烈的负能量平衡作用。C-FOS 蛋白（原癌基因表达产物）作为神经系统的转录因子，可通过广泛的跨突触信号转导、转录刺激快速诱导，在生理、环境、药理学和其他应激刺激下成为急性神经元激活的有力和有效的标志[7-8]，正常生理条件下，在中枢神经系统中只有基础水平的表达，参与细胞的生长、信息传递的功能，在能量平衡的研究中，瘦素等多种参与能量平衡调控的信号也是通过诱导突触后C-FOS 表达进行信号转导的[9-10]。为了深入研究Mex3c 和C-FOS 在神经细胞信号转导中的关系，本研究采用Mex3c 基因敲除小鼠，通过给小鼠注射瘦素（引起负能量平衡效应）和饥饿激素（引起正能量平衡效应），诱导参与能量平衡的信号通路的神经元表达C-FOS，通过检测CFOS 在这些刺激下的表达情况，为Mex3c 调控能量平衡的机制提供解剖学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

正常和Mex3c-/+FVB 的8 周龄小鼠各15 只购自赛业生物有限公司、尼氏染色试剂盒购自凯基生物有限公司、C-FOS 小鼠抗小鼠IgG1 抗体、瘦素（Leptin）购自Proteintech 公司、小鼠二步法检测试剂盒PV-9002、DAB 显色液购自中杉金桥公司、饥饿激素（Ghrelin）购自Tocris 公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组 正常和Mex3c-/+FVB的8 周龄小鼠各15 只，随机均分为6 个组，每组5只。正常对照组：每只小鼠按体质量给予生理盐水 1 μL·g-1腹腔注射；正常瘦素组：每只小鼠按体质量给予瘦素5 μg·g-1腹腔注射；正常饥饿激素组：每只小鼠按体质量给予饥饿激素1 μg·g-1腹腔注射；Mex3c-/+对照组、Mex3c-/+瘦素组、Mex3c-/+饥饿激素组小鼠注射干预也采取腹腔注射。

1.2.2 取脑组织及石蜡包埋 在对生理盐水组、瘦素组、饥饿激素组腹腔注射2 h 后，以1%戊巴比妥钠（0.05 mg·g-1）腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，剪开左心房，从右心室或右心房以生理盐水20 mL 冲洗至组织黏膜泛白，左心室流出液体清亮后继续以4%多聚甲醛10 mL 灌注，缓慢注射，10 min 完成为宜。顺着颅骨缝破开颅骨，小心完整取出脑组织，以4%多聚甲醛固定24 h。固定结束后，用刀片将脑组织修整至理想位置，以新鲜配置的PBS 溶液置于摇床上，缓慢晃动，洗涤脑组织1 h/次，共6 次。梯度酒精脱水（酒精浓度依次为 70%、80%、90%、95%、100%、100%），二甲苯透明至脑组织透亮后以65 ℃融化的石蜡Ⅰ、Ⅱ中浸蜡2 h，包埋后备用。

1.2.3 石蜡切片的HE 染色和尼式体染色 利用震动切片机对包埋好的脑组织进行厚度为4 μm的冠状切片，参考小鼠脑立体定位图谱（第二版）[11]切至下丘脑弓状核（Arc）、背内侧核团（VMH）位置，65 ℃烤箱烘烤 2 h。（1）HE 染色：常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蒸馏水浸泡1 min，放入0.5%苏木精染液中3 min、1%盐酸酒精分化、0.5%伊红染液中染色2 min、经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片，在光学显微镜下观察小鼠Arc、VMH中神经细胞数量、形态变化。（2）尼式染色：对切片进行脱蜡水化后以新鲜配置的PBS 溶液清洗3 min/3 次，经 1%甲苯胺蓝 37 ℃浸染40 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察Arc、VMH 神经核团中尼式小体染色结果。

1.2.4 小鼠下丘脑Arc、VMH 免疫组化染色 烘烤后的切片常规脱蜡、水化、柠檬酸盐抗原修复液高压修复10 min、3%H2O2去除内源性过氧化物酶、山羊血清封闭后滴加小鼠来源的C-FOS一抗（1∶300），37 ℃1 h 或者 4 ℃过夜，PBS 清洗后参考二抗说明书按照试剂盒说明书滴加二抗，DAB 显色后苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后显微镜下观察、拍照。利用ImageJ 软件分析每只小鼠3 个视野下400 倍相同面积阳性细胞表达百分比。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 17.0 软件进行分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验，P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常、Mex3c-/+小鼠脑组织大体形态学观察

解剖后肉眼见，正常、Mex3c-/+小鼠全脑组织大小、形状相近，外形结构光滑，无明显梗死、出血及液化坏死灶等病理变化，见图1。

2.2 各组小鼠脑组织HE 染色观察Arc、VMH 神经核团解剖形态

各组小鼠脑组织Arc、VMH 神经核团的HE染色结果均可见各核团内神经细胞排列密集，大量簇拥，核团组织细胞形态和结构正常，细胞胞浆染色较为致密，未见受损、变性、坏死的神经元，组织染色均匀一致，解剖结构明确清晰，病理学染色正常小鼠和Mex3c-/+小鼠未见明显差异。见图 2～4。

2.3 各组小鼠脑组织尼式染色观察Arc、VMH神经核团尼式小体和神经元

利用甲苯胺蓝尼氏体染色试剂盒对正常、Mex3c-/+小鼠脑组织Arc、VMH 神经核团染色见神经元细胞核明显蓝染，颜色较深，胞质为淡蓝色，可见均匀分布于核周细胞质内蓝色深染的尼氏体，不同神经元中尼氏体染色或深或浅，或见于胞质或位于细胞周边。各组神经元细胞形态大而圆，在Arc、VMH 核团内大量存在，未见核溶解、核固缩现象，无明显空泡状。可见Mex3c-/+不会导致小鼠脑组织发育异常。见图5、6。

2.4 各组小鼠脑组织免疫组化染色观察Arc 神经核团C-FOS 表达

免疫组化结果显示，正常对照组小鼠下丘脑Arc 核团中C-FOS 蛋白表达量较低，在注射瘦素和饥饿激素2 h 后表达量均升高（P＜0.05）；Mex3c-/+对照组与正常对照组相比，C-FOS 的表达量升高（P＜0.05），与正常瘦素组小鼠相比差异无统计学意义（P＞0.05）；给予饥饿激素干预后，Mex3c-/+小鼠C-FOS 的表达量低于Mex3c-/+对照组（P＜0.05）。正常瘦素和饥饿激素组与Mex3c-/+对照、瘦素组之间差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。见图 7、8。

2.5 各组小鼠脑组织免疫组化染色观察VMH神经核团C-FOS 表达

免疫组织化学结果显示：腹腔注射干预后，正常小鼠瘦素和饥饿激素组VMH 核团中的CFOS 蛋白表达量高于对照组（P＜0.05）；Mex3c-/+对照和正常瘦素组小鼠C-FOS 表达均较高，与Arc核团相似；饥饿激素干预后的Mex3c-/+小鼠CFOS 的表达量高于正常对照组（P＜0.05）。正常瘦素和饥饿激素组与Mex3c-/+对照、瘦素组之间差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。见图 9、10。

3 讨论

能量平衡取决于食物摄入调节和能量消耗之间的平衡，下丘脑室旁核（PVN）、Arc、内侧核（DMN）、VMN 和外侧区（LHA）等下丘脑核，通过影响食欲的神经机制，对调节能量平衡至关重要[12-13]。本实验结果验证了C-FOS 蛋白可作为神经元广泛被激活的标志，脑组织在基础条件下C-FOS 的转录为低水平，在给予瘦素、饥饿激素或者其他正负能量平衡干预后下丘脑核团CFOS 的表达量会增加[9-10，14-16]。

Mex3c 在线虫胚胎期通过调控细胞内重要mRNA 的转录参与其早期发育过程，但是在哺乳动物中该基因的功能尚且研究不足。Jiao 等[4]的研究表明，Mex3c 抗体被识别于小鼠体内不同蛋白，表明Mex3c 基因可以翻译不止一种蛋白质。由于Mex3c-/-小鼠缺乏Mex3c 会导致出生后生长迟缓和围产期死亡，从而发现了Mex3c 蛋白在促进IGF1 mRNA 翻译中起着重要的作用。Mex3c杂合和纯合突变小鼠均可见较正常对照小鼠低水平的血糖和血脂，在研究Mex3c 和Leptin 双突变的小鼠生长中，肥胖和生长迟缓与ob/ob 小鼠相似，多方位验证了Mex3c 参与了能量平衡的调控[5，17-18]。

对正常小鼠和Mex3c-/+给予不同干预的实验中，由于C-FOS 作为快速反应蛋白，机体接受刺激后90～120 min 内快速表达并达到高峰[19]，因此本研究采取腹腔给药2 h 后麻醉小鼠取出脑组织。结果显示，正常对照组小鼠Arc 和VMH 的C-FOS 均为低表达，而注射瘦素（引起负能量平衡效应）和饥饿激素（引起正能量平衡效应）后，Arc 和VMH 核团C-FOS 表达量上调，验证了CFOS 参与了下丘脑能量平衡的调控，而瘦素组和饥饿激素组之间并没有差异，更说明了C-FOS作为神经元被激活的广泛性作用。本研究我们的重点聚焦于具有强烈负能量平衡的Mex3c 在调节能量平衡中的作用，已知的C-FOS 蛋白在调控能量平衡的信号转导中发挥重要作用而FOS mRNA 作为Mex3c 基因的潜在靶mRNA，所以猜测Mex3c 可能通过调节C-FOS 的表达来参与下丘脑能量平衡的调控。

Jiao 等[4]发现，Mex3c-/+小鼠的脂肪减少并且小鼠的能量消耗增加，表现为典型的负能量代谢状态。实验结果中我们明显发现Mex3c-/+对照组Arc 和VMH 核团中C-FOS 呈高表达，提示不同条件负能量平衡状态下相似的C-FOS 可诱导性；给予Mex3c-/+小鼠瘦素干预后，并没有发现的C-FOS 蛋白上调，提示瘦素在负能量代谢机体中给予较低的C-FOS 可诱导性，再次了证明Mex3c蛋白调控能量平衡是通过诱导C-FOS 表达来实现的。本研究数据显示，Mex3c-/+小鼠注射饥饿激素后其Arc 和VMH 核团的C-FOS 表达下调，在VMH 核团中，根据所得数据分析Mex3c-/+饥饿激素组和正常对照组小鼠C-FOS 表达量无差异，但是目前尚无相关文献论述Mex3c 基因产物和瘦素、饥饿激素参与调控FOS 表达的关系，代表第一信使的激素或是细胞产物将信号专递给第二信使，引起靶细胞的特定反应，而C-FOS 作为第三信使调控靶基因的表达，改变神经元的兴奋状态从而发挥作用。我们猜测Mex3c 和瘦素、饥饿激素诱导C-FOS 的表达有着相同的调控路径，在复杂的信号传递中存在一定的协同或是竞争性抑制作用，使得Mex3c-/+小鼠在给予瘦素和饥饿激素干预后出现如上结论，该基因在调控能量平衡的机制研究是我们接下来要去完成的。

下丘脑核团之间有复杂而完整的相互联系，通过调节食物摄入和能量消耗来协调能量平衡的维持，研究发现，ghrelin 和leptin 等体液因子通常先作用于Arc 核团，再通过下丘脑神经元之间的互相投射和联系参与能量平衡的调控[20]。Rosas-Vargas 等[21]发现Mex3c 蛋白在小鼠脑组织中表达量明显高于其他部位，尤其是在负责调控能量代谢平衡方面的丘脑和下丘脑，Mex3c 在下丘脑调节能量代谢中可能扮演着重要的角色，它和C-FOS 的相互关系是我们课题组所关注的焦点。

综上所述，本研究发现腹腔注射瘦素、饥饿激素可以明显上调正常小鼠脑核团C-FOS 的表达，而在Mex3c-/+小鼠中，注射饥饿激素后C-FOS表达量明显下调，Mex3c 可通过诱导小鼠下丘脑Arc、VMH 核团C-FOS 的表达进而参与神经信号转导。