丹酚酸A对TNF-α诱导的 人肾小球系膜细胞增殖的作用及机制研究

王增阳，徐 浩，郑 涛，刘中信，徐佳慧，范华英*

（烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、 分子药理和药物评价教育部重点实验室（烟台大学），山东 烟台 264005）

狼疮性肾炎（Lupus Nephritis，LN）是一种由系统性红斑狼疮引起的自身免疫性疾病。肾小球系膜细胞的过度增殖是LN中最严重的病理表现之一[1]。长正五聚体蛋白3（Pentraxin 3，PTX3）与LN的发病相关，在LN患者的血清中表达升高[2]。目前临床上治疗LN的药物仍会引起严重的毒副作用，因此寻找新的治疗药物是目前亟待解决的问题。丹酚酸A提取自丹参，具有良好的抗炎抗氧化和免疫调节作用[3]。本研究通过TNF-α诱导系膜细胞过度增殖，检测丹酚酸A对系膜细胞过度增殖的影响，并初步评价其作用机制。

1 材料与试剂

肾小球系膜细胞购自中科院上海细胞库（BNCC341134）。丹酚酸A由山东靶点药物研究有限公司提供。TNF-α购自Sigma公司。MTT购自碧云天生物技术研究所。PTX3 ELISA试剂盒购自R＆D Systems。NF-κB p65，IκBα抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc。

2 实验方法

2.1 MTT法检测丹酚酸A对TNF-α诱导的肾小球系膜细胞过度增殖的影响

以每孔8000个细胞接种于96孔板，设置对照组、TNF-α组、TNF-α＋不同浓度丹酚酸A干预组。除正常组外，其他各组均加入TNF-α（10 ng/mL），在24 h后加入不同浓度的丹酚酸A培养24小时，每组设置三个复孔。加入MTT溶液（浓度为5 mg/mL）孵育4 h。去除上清，再加入150 μL DMSO溶解甲瓒。在波长为570 nm处测量吸光度，计算细胞存活率。

2.2 ELISA法检测丹酚酸A对TNF-α诱导的PTX3表达的影响

按上述分组处理细胞，收集上清液，根据PTX3酶联免疫分析试剂盒说明书检测PTX3的表达情况。

2.3 Western-Blot法检测丹酚酸A对NF-κB信号通路相关蛋白表达水平

按上述分组处理细胞后提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，然后进行聚丙烯凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂奶粉封闭，用TBST洗膜后孵育一抗4℃过夜。TBST洗膜后孵育二抗室温孵育，显影检测蛋白条带。

3 实验结果

3.1 丹酚酸A显著抑制肾小球系膜细胞的过度增殖

MTT检测结果如表1所示。结果表明丹酚酸A不同浓度组呈剂量依赖性抑制系膜细胞增殖。

表1 丹酚酸A对TNF-α诱导的肾小球系膜细胞过度增殖的抑制作用

3.2 丹酚酸A对TNF-α诱导的PTX3表达的影响

ELISA结果如图1所示，丹酚酸A能够在一定程度上抑制PTX3的表达，且丹酚酸A 100μM组（P＜0.01）对PTX3表达的抑制效果明显优于其他两组。

图1 丹酚酸A对TNF-α诱导的PTX3表达的影响

3.3 丹酚酸A对NF-κB信号通路相关蛋白表达水平的影响

Western Blot结果如图2所示，与TNF-α组相比，不同浓度丹酚酸A组均可抑制p65的蛋白表达并且可以提高IκBα蛋白的表达，且具有显著性差异。

图2 丹酚酸A对NF-κB信号通路相关蛋白表达水平的影响

4 讨 论

LN发病机制比较复杂，肾小球系膜细胞异常增殖使LN的病理表现异常复杂[4]。PTX3产生于炎症部位，参与炎症反应及免疫系统的调节。在LN患者中，PTX3的过表达加重了肾损伤[5]。我们猜想丹酚酸A是否可以通过抑制NF-κB信号通路的激活，从而抑制PTX3的表达。本研究结果表明丹酚酸A可以通过抑制系膜细胞的增殖以及NF-κB通路的激活抑制PTX3的表达，对肾脏具有一定的保护作用。