Müller细胞在视网膜损伤中对视神经节细胞影响的研究进展△

蒋现 颜繁诚 李树宁 方严

Müller细胞是最主要的神经胶质细胞，贯穿视网膜全层。生理状态下，Müller细胞通过调节视网膜细胞间质K+水平、参与谷氨酸代谢等途径，维持视网膜内能量代谢和营养支持。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)是视网膜终端神经元，沿视神经轴突向大脑传递视觉信号。RGCs凋亡导致视网膜内多种神经退行性疾病，例如青光眼和糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)等。在视网膜损伤时，Müller细胞一方面显示神经源性特征再生RGCs，还可通过释放营养因子和提供能量继续维持RGCs的新陈代谢；另一方面Müller细胞自身功能受损发生凋亡，不能维持正常功能进一步加重RGCs的损伤，因此Müller细胞和RGCs之间的相互作用对于维持视网膜微环境平衡十分重要。本文就视网膜损伤下Müller细胞对RGCs的影响进行综述。

1 Müller细胞在视网膜损伤中对RGCs功能的调节作用

1.1 细胞间K+转运及水代谢Müller细胞是视网膜中神经胶质细胞的主要类型，表达多种类型的离子通道，包括依赖电压的离子通道K+通道。Müller细胞表达多种K+通道亚基，主要表达内向整流钾离子通道(inwardly rectifying K channel,Kir) 4.1。K+通道在Müller细胞膜上具有明显的极端分布，这些通道高度集中在Müller细胞的尾足和外侧突中。Müller细胞中的K+通道在维持的静息膜电位和缓冲细胞外K+发挥重要作用。生理状态下，Müller 细胞通过一种叫做K+虹吸的过程维持RGCs离子稳态。为了避免视网膜神经元高K+水平，Müller细胞从细胞外空间吸收过量的K+,并释放到血液和玻璃体液中，这表明Müller细胞中的K+通道在维持神经元的活动十分关键。在大鼠慢性高眼压(chronic ocular hypertension，COH)模型中，Müller细胞通过Kir4.1表达下调导致细胞内神经胶质细胞骨架蛋白表达上调，Müller细胞活化继而减弱K+的缓冲作用,增加水向细胞内的运输，导致视网膜水肿[1-3]。另一方面,Kir4.1通道的下调可减少Müller细胞对谷氨酸的摄取，引发细胞外谷氨酸的积聚和代谢型谷氨酸受体Ⅰ( metabotropic glutamate receptor Ⅰ,mGluR Ⅰ)激活，导致 Müller细胞内向K+电流的减弱,并引起细胞膜去极化，造成视网膜细胞间质K+水平升高。在Müller细胞K+缓冲功能的减弱和RGCs 中K+积聚的双重作用下，离子平衡失调使RGCs电生理紊乱。

生理状态下，水通过专门的膜通道进行细胞内外水运输，大部分由水通道蛋白(aquaporin，AQP)调节。视网膜中最主要的AQP是AQP4，其主要在Müller细胞上表达[4]。在小鼠视神经挤压伤(optic nerve crush，ONC)模型中，视网膜AQP4和Kir4.1蛋白以及mRNA水平均显著降低，提示离子稳态和K+缓冲受损[5]。AQP4降低明显延迟了Müller细胞K+的虹吸作用，细胞间K+的增加可能会导致视网膜神经元过度兴奋和异常同步，进一步加重RGCs的损伤。Müller细胞为了缓冲RGCs释放过量K+导致的渗透压升高，水通过AQP4进入Müller细胞中，继而加重视网膜水肿。

1.2 谷氨酸谷氨酸是视网膜中主要的兴奋性神经递质，用于通过光感受器、双极和神经节细胞传递视觉信号。在细胞外低水平谷氨酸状态下，Müller细胞通过血-视网膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)摄取和代谢谷氨酸来参与突触活动的形成和终止。Müller细胞是维持视网膜稳态所必需的，并能对异常升高的谷氨酸水平做出反应。生理条件下，RGCs释放的过量谷氨酸主要通过L-谷氨酸/L-天冬氨酸转运体(glutamate-aspartate transporter，GLAST)转运至Müller细胞中，然后被谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)快速转化为谷氨酰胺，随后谷氨酰胺被运回神经元进行谷氨酸重新合成。但在青光眼动物模型中，细胞外谷氨酸过量达到毒性水平时，Müller细胞上的GLAST无法清除过多的细胞外谷氨酸，进而加剧细胞外谷氨酸累积。高浓度谷氨酸长时间留存于突触间隙，持续激活突触后膜上的离子通道，促发胞外 Ca2+的大量内流，引发突触后神经元的钙超载，从而激活复杂的核酸酶、蛋白酶、磷脂酶信号途径，生成氧自由基和一些中介物质，导致DNA亚硝基化和片段化，并最终导致神经元的凋亡[6-7]。此外，高浓度谷氨酸引起的氧化应激导致Müller细胞Kir4.1水平显著降低。Kir 电流下调导致细胞膜去极化，破坏Müller细胞维持离子和水的动态平衡以及神经递质的循环利用，影响Müller细胞向RGCs提供营养物质和必需物质，导致神经元凋亡。

1.3 能量代谢研究表明,大脑的主要神经胶质细胞是星形胶质细胞，星形胶质细胞介于血管和神经元之间，缓冲和代谢从血液到神经元的能量底物来维持神经元功能[8]。而与大脑中的星形胶质细胞相似，Müller细胞是视网膜中的主要神经胶质细胞。Müller细胞介于血管和RGCs之间形成BRB，并且能够存储和降解糖原作为能量储备。由于视网膜中Müller细胞-RGCs的相互作用与大脑中星形胶质细胞-神经元中相互作用相似，因此作者总结了视网膜损伤下Müller细胞能量代谢对RGCs的影响。

在氧气充足的情况下，Müller细胞仍主要依赖厌氧的糖酵解方式来提供能量，这种现象被称为瓦博格(Warburg)效应[9-11]。这是因为Müller细胞在缺血、缺氧等状态下具有很强的抵抗各种损伤的能力。在较短时间的葡萄糖缺乏状态下，Müller 细胞可以通过储备的糖原来提供能量代谢[12]。大鼠Müller细胞在葡萄糖缺乏时，葡萄糖糖酵解丙酮酸产生乳酸后，再借助单羧酸转运体从Müller细胞内释放至细胞间，最后被RGCs吸收作为底物参与神经元细胞内的三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环，促进RGCs存活。

值得注意的是，Müller细胞除了释放乳酸作为底物维持RGCs的能量代谢，也可在Müller细胞线粒体通过TCA生成三磷酸鸟苷(guanosine-5’-triphosphate，GTP)和磷酸激酶产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)维持自身能量需求[13]。研究表明，在Müller细胞和RGCs共培养时，加入线粒体抑制剂抗霉素A可降低Müller细胞谷氨酸摄取转运体(excitatory amino acid transporter，EAAT) mRNA的表达，增加RGCs谷氨酸的堆聚。而在DR中，高糖条件增加线粒体膜电位异质性，降低耗氧率和细胞外酸化率，通过Müller细胞释放细胞色素C触发线粒体凋亡途径并破坏电子传递链。与此同时Müller细胞产生凋亡，这提示高糖条件下Müller细胞线粒体功能障碍可能与其凋亡发生有关，中断 Müller对RGCs的能量联系，进一步加剧RGCs凋亡[14]。

2 Müller细胞在视网膜损伤中对RGCs的神经保护作用

Müller细胞在视网膜损伤中做出反应，释放色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，BFGF)和脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)等神经保护因子，促进视网膜神经节细胞的存活。过去也有大量学者研究证实这一观点，而作者总结发现，Müller细胞在释放这些因子后，既可通过直接方式，又可通过间接方式促进RGCs在视网膜损伤中的存活。

PEDF是Müller细胞释放的一种相对分子质量为50 000多功能神经营养因子，具有神经保护、神经营养、血管抑制、抗氧化和抗炎作用。尽管PEDF的神经保护机制尚未阐明，但是已有大量研究证明其保护作用。过去研究表明，PEDF是由于部分核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路的激活间接促进的RGCs存活率的提高，例如视网膜缺血/再灌注损伤时，Müller细胞分泌PEDF作用于神经元细胞激活NF-κB，编码神经保护蛋白的基因转录，诱导神经营养因子(nerve growth factor,NGF)、BDNF、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)和B细胞淋巴瘤-特大型(B-cell lymphoma-extra large, Bcl-xL)的表达，并下调凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)的活性促进RGCs的存活[15-18]。此外，PEDF受体在氧化应激、缺氧等病理条件下也参与了PEDF介导的神经保护作用。例如Müller细胞在低氧条件下与RGCs共培养，可通过信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)激活和部分通过PEDF受体促进RGCs存活。同时，最新研究表明在ONC下，PEDF可直接通过抑制视网膜细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2(cysteine-containing aspartate-specific proteases-2，CASP-2) mRNA的表达，同时抑制RGCs与CASP-2凋亡途径中下游磷酸化JUN基因编码的蛋白质和Bcl-2水平参与RGCs的保护[19]。

BFGF是由155个氨基酸合成的相对分子质量为18 000神经营养因子，存在于Müller细胞和RGCs等。BFGF是一种促进神经元存活和突起生长的营养因子，在多种细胞发育中促进有丝分裂，并可刺激视网膜微血管内皮细胞增殖和诱导神经节细胞轴突生长。之所以视网膜Müller细胞被认为是神经保护和新生血管生成的关键细胞，是因为在持续的低氧和缺血中，Müller细胞是BFGF的主要来源。视网膜新生血管的生成对神经元存活十分重要，例如，视网膜长期缺氧条件下Müller细胞部分通过BFGF传导引起细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)上的苏氨酸202和酪氨酸204的磷酸化增加，激活ERK(1/2)/丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路刺激血管内皮细胞增殖，减缓RGCs的凋亡[20]。除了间接刺激新生血管生成促进RGCS存活，在其他视网膜损伤如蛙视神经轴突切断模型中，BFGF可直接通过ERK途径增加抗凋亡蛋白的数量，并且显著降低凋亡效应蛋白，从而阻止RGCs的凋亡[21]。

BDNF是由2条相同肽链以非共价键结合的蛋白质二聚体组成，包含神经生长因子、神经营养蛋白3和神经营养蛋白4/5。BDNF属于神经营养因子蛋白家族成员，神经营养蛋白在神经系统中促进神经元的存活，并维持其稳定性[22]。研究表明，在大鼠视网膜Müller细胞和神经节细胞中均表达BDNF，而BDNF高亲和力受体肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)只在Müller细胞中表达[23]。在视神经损伤动物模型中，BDNF直接刺激Müller细胞TrkB信号钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ型δ链(calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ delta chain，CaMKIIδ)-激活型转录因子1(mammalian achaete-scute homolog 1，Mash1)通路，诱导Müller细胞分化成为视网膜祖细胞，促进RGCs的生成[24-25]。另一方面，在缺氧条件下，BDNF诱导Müller细胞中释放BFGF，间接促进RGCs在视网膜损伤中的存活[26]。

3 介导相关免疫炎症因子对RGCs的损伤

视网膜血管区富含星形胶质细胞，这种特殊的分布使得星形胶质细胞与视网膜血管系统密切相关。过去大量研究证实，在视网膜损伤中，星形胶质细胞能够上调炎症因子各种基因的表达[27]。而Müller细胞介于血管和RGCs之间形成BRB，并通过该屏障向RGCs提供营养物质。那么在视网膜损伤中，Müller细胞是否也参与了炎性因子的表达？近年学者发现在高糖条件下，Müller细胞与RGCs共培养时比RGCs进行单独培养存活率更低[28]，并且共培养时Müller细胞分泌白细胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平显著增加。那么这些炎性因子释放在RGCs凋亡中产生作用，以下阐述其中相关可能机制。

TNF-α是一种重要的促炎因子，由相对分子质量为26 000的Ⅱ型跨膜蛋白组成。TNF-α作为一种内源性致热原，能够促使发热、引起细胞凋亡、引发炎症、阻止肿瘤发生和病毒复制。在青光眼高眼压模型中，Müller细胞上调肌球蛋白受体激酶C.T1(tropomyosin receptor kinase C.T1，TrkC.T1)产生磷酸化激活的ERK(phospho-ERK，p-Erk)使得TNF-α升高，激活钙渗透-α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(calcium permeable-α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor,CP-AMPARs)成为RGCs死亡的主要诱因[29-30]。除此之外，升高的TNF-α还可通过肌动蛋白细胞骨架的解聚以及Kir4.1和突触相关蛋白97(synapse associated protein 97，SAP-97)复合物的解离来抑制Kcnj10(Kir 4.1的基因)的表达，导致视网膜Müller细胞功能障碍加速RGCs的损伤[31]。

IL-1β是作为相对分子质量为35 000的前体产生的促炎细胞因子，但是在炎性体激活后，CASP-1将其裂解为相对分子质量为17 000的活性形式[32]。活跃的IL-1β可诱导巨噬细胞向视网膜外浸润，激活IL-6以及调控趋化因子的表达。最近在DR和COH动物模型中，Müller细胞通过磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1，PLC-γ1)刺激 CD40引起细胞外ATP释放，并促进嘌呤P2X7受体(purinergic receptor P2X 7，P2X7R)-核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide-binding oligomerization domain,leucine rich repeat and pyrin domain containing 3，NLRP 3)通路活化分泌IL-1β，激活Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)-NLRP1/NLRP3-CASP8轴导致RGCs凋亡[32-34]。

IL-6是一种相对分子质量小于30 000的小糖蛋白[35]，介导促炎反应，也具有营养、抗凋亡和抗炎特性的神经保护潜力。在健康视网膜中，IL-6的表达通常很低，但在视网膜损伤中会大幅上调。DR动物模型中，Müller细胞通过IL-1β激活p38 MAPK和ERK1/2信号通路，从而刺激经典的IL-6通路，使得IL-6与膜结合型 IL-6受体和糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)结合，产生内源性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)，导致生成新生血管促进RGCs存活[36-38]。IL-6也可通过Janus激酶/信号转导子和转录激活因子-3(Janus kinase，JAK/signal transducers and activators of transcription 3，STAT 3)和磷脂酰肌苷3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K/protein-serine-threonine kinase，Akt)，显著增加神经突起生长[39]。

4 其他

4.1 视网膜神经元的祖细胞Müller细胞是多能的视网膜干细胞[40]。近年研究表明，斑马鱼在视网膜发育过程中，放射状Müller细胞在神经形成后生成，在视网膜损伤后增殖并表达神经元标记物，具有潜在的神经源性功能[41]。在病理状态如急性光损伤时，损伤附近的Müller细胞部分短暂去分化，重新表达视网膜祖细胞和干细胞的标记物，并进入细胞周期，通过细胞间核迁移(神经上皮细胞的特征)和不对称的自我更新分裂中分裂1次，生成视网膜祖细胞。这种子细胞迅速增殖，形成紧密的神经源性簇围绕着Müller细胞；随后沿着径向纤维迁移到相应的板层，以替换缺失的视网膜神经元[42]。在视网膜损伤反应中，鱼类Müller细胞表现出一些神经源性特征，提示了其再生视网膜神经元的潜在能力。

近年学者在青光眼模型中发现，Müller细胞去分化为视网膜干细胞后用慢病毒pGC-FU-Atoh7-GFP转染，通过抑制RGCs细胞重要转录因子Atoh 7的Notch信号通路向视网膜神经节细胞分化[43-45]。具有干细胞特性的Müller细胞存在于成人视网膜中，但不具有再生能力[46]。但Müller细胞衍生RGCs的同种异体移植可附着在视网膜上，增强视网膜功能。这也提示成人视网膜Müller细胞再生RGCs的潜力，为治疗视网膜损伤疾病提供了方向。

4.2 自噬自噬是指细胞将某些可降解成分(如错误折叠的蛋白质)由自噬体包裹，继而传递至溶酶体进行降解。当细胞暴露于生理应激刺激下，例如高糖时自噬可以被激活[47-48]。自噬是维持细胞动态平衡的过程，过度自噬则会加重细胞损伤。高糖条件下细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的升高导致错误折叠的蛋白质增加，产生持续的内质网(endoplasmic reticulum，ER)应激反应[49]。当ER压力传感器真核细胞起始因子2a(eukaryotic initiation factor-2a，elf2a)磷酸化时，Müller细胞通过上调自噬标记蛋白(Beclin-1)信号激活自噬机制。因此，在细胞质中更多自噬体的产生和自噬底物积累(sequestosome 1，p62/SQTSM1)。由于溶酶体蛋白水解活性受损，p62/SQTSM1未发生降解。堆聚的p62/SQTSM1可通过增加p62/SQTSM1-caspase 8相互作用来增加Müller细胞凋亡[50]。Müller细胞的自噬功能障碍一方面导致自身凋亡，另一方面通过亚硝酸根水平的增加使VEGF过度表达，过量的视网膜新血管形成导致血-视网膜屏障的破坏，Müller细胞对RGCs的营养和能量支持中断[51]。

5 展望

综上所述，视网膜损伤时Müller细胞除了释放营养因子和提供能量底物，还显示神经源性特征再生RGCs，这都显示了Müller细胞维持RGCs稳态的积极影响。但损伤加重时为了维持RGCs稳态，Müller堆积的代谢产物无法及时循环利用导致细胞功能受损(如线粒体)，一方面Müller释放TNF-α等炎性因子，可诱导RGCs凋亡；另一方面，Müller细胞自噬功能受损而凋亡，中断对RGCs的营养和能量支持。这说明视网膜损伤下，Müller细胞对RGCs的生存具有两面影响，但对于这一方面的研究尚不够成熟。因此深入研究Müller细胞与视网膜损伤RGCs凋亡的关系，可为视神经保护治疗提供新的思路。