二氢丹参酮 Ⅰ 通过核因子κB信号通路抑制卵巢癌进展的研究Δ

彭翔云，王 鹤，王 岚，李秋萍

(1.广西壮族自治区南溪山医院妇科，广西 桂林 541002； 2.广西医科大学附属肿瘤医院肿瘤妇科，广西 南宁 530021； 3.桂林市人民医院妇科，广西 桂林 541001)

卵巢癌为威胁女性生殖健康的常见恶性肿瘤，其发病率仅次于子宫颈癌，而死亡率在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位[1]。卵巢癌的治疗多采用手术联合放疗/化疗的综合治疗手段[2]。研究结果显示，铂类药物可有效杀伤卵巢癌细胞，但有约75%的晚期卵巢癌患者可出现耐药性，影响疗效[3]。丹参为临床常用的具有活血化瘀作用的中药，二氢丹参酮Ⅰ是从丹参中提取的脂溶性菲醌类有效成分[4]。近年来研究结果显示，二氢丹参酮Ⅰ可通过抑制Wnt/β-Catenin信号转导通路，诱导骨肉瘤143B细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移和侵袭[5]。核因子κB(NF-κB)为普遍存在于几乎所有动物各类型细胞中的转录因子蛋白家族。NF-κB可与多种基因启动子和增强子序列位点特异性结合，调节基因转录和表达[6]。研究结果显示，大多数参与免疫、炎症和应激等反应以及调控细胞分化、增殖和凋亡过程的分子受NF-κB调控[7-8]。于秀冰[9]的研究结果发现，卵巢癌组织中NF-κB蛋白阳性表达率较高，且与淋巴结转移、组织学分化程度及临床分期密切相关。因此，本研究主要基于NF-κB信号通路探讨二氢丹参酮Ⅰ对卵巢癌细胞生物学行为的影响，旨在为临床治疗提供更多参考。

1 材料

1.1 仪器

流式细胞分析仪(美国贝克曼公司)；酶标仪(美国赛默飞公司)；凝胶成像分析系统(美国伯乐公司)。

1.2 细胞及主要试剂

人卵巢癌细胞株SKOV3(上海慧颖生物科技有限公司)。DMEM高糖培养基、10%胎牛血清、0.25%胰酶溶液、鼠抗人β-actin单克隆抗体、鼠抗人NF-κB单克隆抗体、鼠抗人P65单克隆抗体、鼠抗人B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)单克隆抗体及HPR标记羊抗鼠免疫球蛋白G均购自美国赛默飞公司；青霉素、链霉素购自上海生工生物股份有限公司；二氢丹参酮Ⅰ对照品(成都蔓斯特生物科技有限公司)；MTT溶液(上海酶联生物科技有限公司)；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；ECL化学发光检测试剂盒(上海爱必信生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 细胞培养与药物制备

(1)细胞培养：液氮中取出人卵巢癌细胞株SKOV3，置于含10%胎牛血清以及100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔日更换1次培养液，显微镜下观察细胞生长情况，当细胞融合度> 80%时进行传代培养；弃去培养液，滴加0.25%胰酶溶液消化细胞，倒置显微镜下观察细胞消化，当细胞逐渐变圆时，倒掉溶液加入新的培养液终止消化；吸管轻轻吹打瓶底贴壁细胞制成细胞悬液，移至离心管中离心5 min，1 000 r/min，弃上清液，加入2 ml新的培养液重悬细胞，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。(2)药物制备：以二甲基亚砜作为溶剂溶解二氢丹参酮 Ⅰ，以DMEM高糖培养基稀释后制成0、2、4、6、8及10 μmol/L的混合液，记为实验组。

2.2 细胞增殖检测

采用四唑盐比色法检测二氢丹参酮Ⅰ对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖的影响。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于96孔板中，100 μl/孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养；待细胞贴壁后，滴加不同浓度二氢丹参酮Ⅰ溶液，以仅滴加100 μl培养液作为空白对照组，分别于24和48 h后加入20 μl的MTT溶液，室温(25 ℃)孵育4 h后，弃去溶液加入150 μl的二甲基亚砜；待沉淀完全溶解后，利用酶标仪测波长492 nm处的光密度(OD)，绘制细胞存活曲线计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率(%)=(1-OD实验组/OD空白对照组)×100%。

2.3 细胞迁移能力检测

采用细胞划痕实验检测二氢丹参酮Ⅰ对人卵巢癌细胞株SKOV3迁移的影响。用Marker笔在24孔板底部，均匀划横线，横穿过孔，每孔至少穿过5条线；取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105个/ml，接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中过夜培养；24 h后，待细胞汇合至单层细胞层时，利用200 μl枪头进行划痕；PBS溶液清洗3次后，滴加不同浓度二氢丹参酮Ⅰ溶液，以仅滴加100 μl培养液作为空白对照组；48 h后，弃去培养液，PBS溶液清洗3次，显微镜下观察划痕距离，实验重复3次取平均值。

2.4 细胞凋亡检测

采用流式细胞术检测二氢丹参酮Ⅰ对人卵巢癌细胞株SKOV3凋亡的影响。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105个/ml，接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中过夜培养；弃去培养液，滴加不同浓度二氢丹参酮Ⅰ溶液，以仅滴加100 μl培养液作为空白对照组，于37 ℃、5%CO2培养箱中过夜培养；将培养液转移至离心管中，离心5 min，1 000 r/min，弃上清液，PBS溶液清洗3次；按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞分析仪检测细胞凋亡，利用FlowJo 7.6软件分析数据。

2.5 NF-κB信号通路相关蛋白检测

采用蛋白免疫印迹检测二氢丹参酮Ⅰ对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105个/ml，接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中过夜培养；弃去培养液，滴加不同浓度二氢丹参酮Ⅰ溶液，以仅滴加100 μl培养液作为空白对照组，于37 ℃、5%CO2培养箱中过夜培养；PBS溶液清洗3次，收集细胞于EP管中，滴加RIPA裂解液，30 min后离心15 min，12 000 r/min；取上清液转移至新的EP管内，利用酶标仪测波长490 nm处的OD对蛋白进行定量分析；采用湿转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，滴加5%脱脂牛奶封闭60 min；以β-actin蛋白作为内参蛋白，分别滴加鼠抗人β-actin单克隆抗体、鼠抗人NF-κB单克隆抗体、鼠抗人P65单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体，稀释比例为1∶1 000，4 ℃下过夜孵育；PBS溶液清洗3次，滴加相应二抗，稀释比例为1∶5 000，室温封闭1 h；按照ECL化学发光检测试剂盒说明书操作，利用凝胶成像分析系统分析条带，测定各条带OD值。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞增殖的影响

与0 μmol/L比较，2、4、6、8及10 μmol/L二氢丹参酮Ⅰ作用下的SKOV3细胞OD明显降低；与二氢丹参酮Ⅰ作用24 h相比，作用48 h的SKOV3细胞OD明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。随着二氢丹参酮Ⅰ浓度增加，作用时间延长，二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞增殖的抑制作用越明显，有剂量和时间依赖性，见表1。

表1 二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞增殖的影响Tab 1 Effect of dihydrotanshinone Ⅰ on the activity of

3.2 二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞迁移的影响

与0 μmol/L比较，2、4、6、8及10 μmol/L二氢丹参酮Ⅰ作用下的SKOV3细胞划痕距离明显延长；与二氢丹参酮Ⅰ作用24 h相比，作用48 h的SKOV3细胞划痕距离明显延长，差异均有统计学意义(P<0.05)。随着二氢丹参酮Ⅰ浓度增加，作用时间延长，二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞迁移的抑制作用越明显，有剂量和时间依赖性，见表2、图1。

表2 二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞迁移的影响Tab 2 Effect of dihydrotanshinone Ⅰ on the migration

图1 二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞迁移的影响(细胞划痕实验)Fig 1 Effect of dihydrotanshinone Ⅰ on the migration of SKOV3 cells (Cell scratch test)

3.3 二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞凋亡的影响

与0 μmol/L比较，2、4、6、8及10 μmol/L二氢丹参酮Ⅰ作用下的SKOV3细胞凋亡率明显升高；与二氢丹参酮Ⅰ作用24 h相比，作用48 h的SKOV3细胞凋亡率明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。随着二氢丹参酮Ⅰ浓度增加，作用时间延长，二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞凋亡的促进作用越明显，有剂量和时间依赖性，见表3、图2。

图2 二氢丹参酮 Ⅰ 对SKOV3细胞凋亡的影响(流式细胞术)Fig 2 Effect of dihydrotanshinone Ⅰ on the apoptosis of SKOV3 cells (Flow cytometry)

与0 μmol/L比较，*P<0.05vs. 0 μmol/L, *P<0.05图3 二氢丹参酮Ⅰ对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响(蛋白免疫印迹法)Fig 3 Effect of dihydrotanshinone Ⅰ on the expression of NF - κ B signaling pathway related proteins (Western blotting)

表3 二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞凋亡的影响Tab 3 Effect of dihydrotanshinone Ⅰ on the apoptosis

3.4 二氢丹参酮Ⅰ对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

不同浓度二氢丹参酮Ⅰ处理后的SKOV3细胞NF-κB、P65和Bcl-2蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；随着二氢丹参酮Ⅰ浓度增加，二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞NF-κB、P65和Bcl-2蛋白表达的抑制作用越明显，有剂量依赖性，见图3。

4 讨论

卵巢癌为女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，全球每年有超过23万的卵巢癌新发病例，死亡人数达15万[10]。根据组织学类型不同，卵巢癌可分为上皮性癌、非上皮性癌和转移性癌，其中上皮性癌为临床最常见类型[11]。人卵巢癌细胞株SKOV3来源于人卵巢癌，正常细胞形态为上皮样。丹参为唇形科鼠尾草属植物，具有活血调经、祛瘀止痛等功效[12]。研究结果显示，丹参在女性月经不调、不孕和痛经等的治疗中可发挥活血调经的作用，疗效确切[13]。丹参的主要有效成分包括水溶性酚酸类和脂溶性二萜醌类成分[14]。近年来研究结果显示，以丹参为代表的活血化瘀类中药的有效成分具有广泛的抗肿瘤生物活性[15]。张梦阳等[16]的研究结果发现，丹参脂溶性二萜醌类有效成分可通过抑制炎症介质表达，改善肿瘤炎症微环境，达到抗肺癌的作用。丹参酮ⅡA和二氢丹参酮Ⅰ为常见的丹参脂溶性二萜醌类有效成分。袁建华等[17]的研究结果发现，丹参酮ⅡA可通过调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达，促进肝癌HepG2细胞凋亡和抑制肿瘤体积增长。程协枝等[18]的研究结果发现，二氢丹参酮可通过抑制c-Myc蛋白表达，阻碍Wnt/β-catenin信号转导，抑制大肠癌SW480细胞增殖。

本研究采用不同浓度二氢丹参酮Ⅰ处理SKOV3细胞，结果发现，随着二氢丹参酮Ⅰ浓度增加，作用时间延长，二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞增殖和迁移的抑制作用和对SKOV3细胞凋亡的促进作用越明显，有剂量和时间依赖性，提示二氢丹参酮Ⅰ对卵巢癌增殖和迁移有较强的抑制作用，并可诱导细胞凋亡，这种作用有时间-浓度依赖性，二氢丹参酮Ⅰ有可能成为治疗卵巢癌的新药。NF-κB是具有多向性调节作用的蛋白质分子，参与调控多种因子的基因表达。朱熠等[19]的研究结果发现，NF-κB信号通路的活化是造成卵巢癌复发、转移和预后差的主要因素之一。Ignacio等[20]的研究结果发现，NF-κB介导的巨噬细胞炎症蛋白20抗体在细胞表面趋化因子受体2抗体驱动卵巢癌进展中占主导地位。本研究结果发现，随着二氢丹参酮Ⅰ浓度增加，二氢丹参酮Ⅰ对SKOV3细胞NF-κB、P65和Bcl-2蛋白表达的抑制作用越明显，有剂量依赖性，提示二氢丹参酮Ⅰ可能通过下调NF-κB、P65和Bcl-2蛋白表达，抑制NF-κB信号通路，诱导细胞凋亡，抑制人卵巢癌细胞株SKOV3增殖和迁移。

综上所述，二氢丹参酮Ⅰ可能通过下调NF-κB、P65和Bcl-2蛋白表达，抑制NF-κB信号通路，诱导细胞凋亡，抑制人卵巢癌细胞株SKOV3增殖和迁移。