基于整合药理学平台V2.0的少腹逐瘀汤治疗原发性痛经分子机制研究Δ

高宏杰，李 君，贡磊磊

(1.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700； 2.中国中医科学院西苑医院检验科，北京 100091； 3.首都医科大学附属北京妇产医院药事部，北京 100026)

痛经是指经期或行经前后，出现周期性下腹疼痛、坠胀，或痛引腰骶，甚则剧痛昏厥[1]。临床上根据有无盆腔器质性疾病将痛经分为原发性痛经(primary dysmenorrhea，PD)和继发性痛经(secondary dysmenorrhea，SD)。PD是指生殖器官无明显器质性病变；SD是由生殖器官的器质性疾病引起的，如盆腔炎、子宫内膜异位症及子宫肌瘤等[2]。研究结果表明，我国痛经的发生率为33.1%，其中PD患者占53.2%，严重的PD影响女性正常工作和生活质量。PD发病机制包括机械因素、内分泌因素、钙离子水平、情绪、运动、饮食和环境等因素[3]。西医常采用非甾体抗炎药治疗PD，虽然能够减轻疼痛，但易引起胃肠道等不良反应，且多数患者不能耐受。中医药在治疗PD方面有许多行之有效的方法，并且在远期疗效方面有独特的优势[4]。少腹逐瘀汤是由小茴香(炒)、干姜(炒)、延胡索、没药、当归、川芎、官桂、赤芍、蒲黄和五灵脂(炒)等10味中药组成的复方制剂。该方出自于清代《医林改错》，具有活血祛瘀、温经止痛的功效，为治疗寒凝血瘀型痛经的经典方剂[5]。临床研究结果表明，少腹逐瘀汤治疗PD疗效显著，具有温经散寒、化瘀止痛的功效，可有效帮助PD患者减轻疼痛，缩短疼痛持续时间[6]。并且少腹逐瘀汤改善PD症状的整体有效率优于布洛芬缓释胶囊、痛经宝颗粒、消炎痛片及吲哚美辛等药物[7]。研究结果表明，少腹逐瘀汤通过抑制炎症、缓解疼痛，从而改善PD。少腹逐瘀汤治疗PD的研究多集中于临床研究，尚无对其作用机制的研究。整合药理学V2.0是以中医药大数据为驱动，以模型构建和生物信息技术为手段开发的一个网络版的中药整合药理学数据和计算平台[8]。该平台同时集成了靶标预测、数据挖掘、网络构建和分析可视化等网络药理学模块，实现一站式服务，为解析中药方剂复杂体系作用机制提供了强有力的帮助[9]。平台具备中药分子机制研究及中药质量标志物发现与应用等多项功能[10-14]。因此，本研究采用整合药理学平台V2.0，探讨少腹逐瘀汤治疗PD的作用机制，为临床研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 少腹逐瘀汤化学成分来源及靶标预测

通过整合药理学平台V2.0收集少腹逐瘀汤中小茴香、干姜、延胡索、没药、当归、川芎、官桂、赤芍、蒲黄和五灵脂等10味中药的化学成分，建立少腹逐瘀汤成分数据库。并且利用药材化学成分二维结构(.mol)与DrugBank中认证药物(approved)进行化学指纹特征比对，以Tanimoto系数进行相似性打分，分值>0.8为相似性的药物，以相似性药物作用靶标为药物候选靶标。

1.2 PD疾病靶标收集

在整合药理学平台V2.0中收集PD疾病靶标，即在疾病相关分子库输入“dysmenorrhea”收集痛经疾病靶标。

1.3 少腹逐瘀汤与PD核心靶标网络构建及功能、通路分析

基于少腹逐瘀汤候选靶标和PD疾病靶标之间的相互作用关系，构建“中药-疾病”关联网络。最后借助中医药关联网络挖掘模块构建“中药-成分-靶标-通路”多维网络，对少腹逐瘀汤与PD之间的关系进行可视化分析。

2 结果

2.1 药材化学成分、疾病靶标预测结果

基于整合药理学平台V2.0，共收集到9味药材的352种化学成分和1 903个靶标，其中小茴香的化学成分70个，药物靶标306个；干姜的化学成分54个，药物靶标7个；延胡索的化学成分35个，药物靶标563个；没药的化学成分17个，药物靶标9个；当归的化学成分81个，药物靶标1 185个；川芎的化学成分84个，药物靶标946；官桂的化学成分14个，药物靶标59个；赤芍的化学成分9个，药物靶标50个；蒲黄的化学成分35个，药物靶标318个。其中五灵脂为动物药，平台暂未收集该药的化学成分及相应药物靶标。通过整合药理学V2.0，共收集疾病靶标15个。

2.2 疾病靶标和药物靶标核心网络分析

通过整合药理学平台V2.0，共获得63个与少腹逐瘀汤和PD的核心网络靶标，采用PPI模块构建了“药物-疾病核心靶标”网络,见图1。其中药物和疾病共有靶标有3个，分别为PPARG、PTGS2和CYP17A1。在平台中设定同时满足大于 “介度”“紧密度”及“连接度”的中位数卡值，最终得到核心靶标25个，见表1。这些核心靶标主要为药物潜在的靶标，如DRD2、DRD3、DRD4、AKT1、HTR1B、HTR1D、HTR1A及ESR1等靶标。

图1 “药物-疾病核心靶标”网络Fig 1 Core target network of drug-disease

表1 药物-疾病核心靶标Tab 1 Core target list of drug-disease

2.3 “中药-成分-靶标-通路”网络可视化分析结果

基于整合药理学平台，获得了少腹逐瘀汤治疗PD的核心靶标，推测少腹逐瘀汤可能通过干预药物和疾病共有靶标发挥药效，利用核心靶标及与药物成分和疾病之间的关系绘制“中药-成分-靶标-通路”多维网路，见图2。从图中可以发现，少腹逐瘀汤中的木蜡酸(lignoceric acid)、异丁香酚(isoeugenol)、丁香油酚(eugenol)、异鼠李素(isorhamnetin)、槲皮素(quercetin)及川芎萘呋内酯(wallichilide)等成分通过作用于ESR1、CNR1、CALM1、CYP19A1、HSP90AA1、AKT1及NFKB1等靶标参与五羟色胺受体(serotonin receptor)、多巴胺受体(dopamine receptor)、eNOS活化(eNOS activation)、VEGFR2介导的血管通透性(VEGFR2 mediated vascular premeability)，四氢生物喋呤(BH4)的合成、回收、修复和调控[Tetrahydrobiopterin(BH4)synthesis, recycling, salvage and regulation])，VEGFA-VEGFR2通路(VEGFA-VEGFR2 pathway)以及SLC2A4向血浆膜的易位[Translocation of SLC2A4(GLUT4) to the plasma membrance]等通路。

图2 “中药-成分-靶标-通路”多维网络图Fig 2 Multidimensional network of Chinese medicine-component-target-pathway

3 讨论

PD是妇科常见疾病之一，多发于青春期少女、未婚或未孕的年轻女性[15]。PD具有较高的发病率，严重影响女性生活和工作质量。目前，常采用具有抗炎、镇痛和解热作用的非甾体抗炎药以及口服避孕药进行治疗，但容易引起激素紊乱和胃肠道反应，并且，长期服用可使患者对药物的敏感性降低，导致疗效降低[4]。近年来，越来越多的女性倾向于中医药治疗。中医理论认为，痛经主要分为寒凝血瘀、气滞血瘀、肝肾亏虚、阳虚内涵、气血虚弱和湿热内阻等证型，其中以寒凝血瘀和气虚血瘀最为常见[1]。少腹逐瘀汤为治疗寒凝血瘀证的常用方剂，临床研究结果表明，少腹逐瘀汤治疗寒凝血瘀证痛经的总有效率为96%[16]。并且，少腹逐瘀汤能够降低PD患者雌激素和孕激素疼痛程度积分，升高孕激素和前列腺素E2水平，具有较好的临床效果[17]。但有关少腹逐瘀汤治疗PD主要集

中于临床研究，而其作用机制研究尚未报道。因此，本研究采用整合药理学平台V2.0分析了少腹逐瘀汤治疗PD的潜在靶标，并构建了药物靶标和疾病靶标网络，最后通过“中药-成分-靶标-通路”多维网络，进一步阐明了少腹逐瘀汤作用于PD潜在的靶标及通路。

本研究通过分析少腹逐瘀汤与痛经疾病靶标之间的相互作用关系，构建了核心靶标网络，该网络中共有3个共有靶标，分别为PPARG、PTGS2及CYP17A1。研究结果表明，PPARG是一种配体依赖的核转录因子，属于Ⅱ型核激素受体超家族成员，PPARG在腹膜子宫内膜异位病变中的表达与痛经相关，配体激活的PPARG通过调节免疫炎症反应参与机体的生理和病理过程[18]。COX-2是前列腺素生物合成中的关键酶，由PTGS2编码合成，患有痛经的女性体内前列腺素水平很高，而非甾体抗炎药是通过阻断前列腺素生成而起作用的药物。因此，PTGS2在女性痛经治疗的重要靶标[19]。进一步的多维网络图分析可知，槲皮素、异鼠李素、丁香酚及异丁香酚等成分通过作用于ESR1、CNR1、CALM1、CYP19A1、HSP90AA1、AKT1和NFKB1等靶标参与的五羟色胺受体、多巴胺受体及eNOS活化等通路发挥作用。PD与子宫内膜前列腺素升高有关，前列腺素过高会刺激子宫异常收缩，而槲皮素能够抑制PGF2α引起的子宫平滑肌收缩，减轻痛经[20]。此外，蒲黄中的异鼠李素3-O-新橙皮苷为治疗痛经、子宫出血等疾病的有效成分[21]。有研究报道，ESR1基因Pvull多态性在PD患者和对照组患者之间显示出统计学差异[22]。

本研究采用整合药理学平台，建立了少腹逐瘀汤与PD的核心网络，进一步构建了“中药-成分-靶标-通络”多维网络，2个核心网络相结合，为阐明少腹逐瘀汤治疗PD的作用机制提供了参考，也为进一步实验研究、临床应用提供了理论依据。