广东紫珠提取物对母猪繁殖性能、免疫、抗氧化功能及肠道微生物的影响

陈小连，宋文静，周泉勇，宋琼莉，邹志恒，刘林秀，胡利珍，韦启鹏*，严景生，达列亚·阿合买提

（1.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，南昌330200；2.江西省井冈山市畜牧兽医局，江西 井冈山343604；3.新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，乌鲁木齐830063）

广东紫珠（Callicarpa kwangtungensisChun.），别名紫珠草，是马鞭草科紫珠属落叶灌木，主要分布在江西、湖南、湖北、广东、广西等地[1]，2010 年被纳入中国药典，临床主要用于治疗宫颈炎、盆腔炎与阴道炎等妇科炎症，疗效显著，是“抗宫炎片”“抗宫炎胶囊”等中成药的主要原料[1-2]。广东紫珠富含苯乙醇苷类（如连翘酯苷B和金石蚕苷）、黄酮类、萜类和酚酸类等活性成分[3-6]，其中苯乙醇苷类和黄酮类具有显著的抑菌、抗炎、抗氧化、增强免疫力等功效[3,6-8]。目前，广东紫珠在人医临床上已广泛应用，在兽医临床上的应用也取得显著成效。魏运锑[9]报道了利用紫珠草成功治愈牛顽固性衄血、牛血痢、母牛产后血崩、猪恶毒肿痛等病例。孔育玲等[10]利用含紫珠草浸膏、益母草浸膏等组方的饲粮饲喂临产母猪5～6 d，母猪产后“三联症”的发病率和仔猪黄白痢发病率均较对照组低，断奶仔猪头数和断奶平均窝体质量显著高于对照组；王胜萍等[11]在产后母猪基础日粮中添加紫珠浸膏粉7 d，也得到类似结果。随着抗生素在饲料中的全面禁用，在母猪饲粮中使用无公害、无残留、无耐药性的绿色饲料添加剂替代饲用抗生素已成为国内外研究的热点。广东紫珠提取物属纯天然物质，作为绿色饲料添加剂在母猪生产上还鲜有报道。而深入开展广东紫珠提取物作用于母猪抑菌、抗炎和抗氧功能的有效成分及作用机制研究，对减少抗生素等药物使用、研制抗生素替代品和大力发展生态健康养殖具有重要而深远的意义。本文研究了在妊娠和哺乳母猪饲粮中添加广东紫珠提取物对母猪免疫力、繁殖性能、抗氧化功能和肠道微生物的影响，旨在为广东紫珠在养猪生产上的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用广东紫珠提取物购于湖南华康生物科技股份有限公司，为棕黄色粉末，带有特殊气味，含连翘酯苷B 20 mg/kg，金石蚕苷15 mg/kg。

1.2 试验设计与饲养管理

选取体质量、胎次（3～5胎）和预产期相近的健康妊娠母猪50 头，随机分成5 组，每组5 个重复，每个重复2 头母猪。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加50、100、150和200 mg/kg广东紫珠提取物的饲粮，饲粮组成及营养水平见表1。试验期从母猪妊娠第30 天开始至分娩后第25天结束。妊娠期试验母猪在妊娠舍定位栏内饲喂，饲喂量控制在2.0～3.5 kg/d 之间，自由饮水。产前第3天转入产房，限制饲喂。分娩当天不饲喂，分娩后第1天饲喂1 kg饲粮，随后每天增加1 kg，直到自由采食。试验猪均严格按照猪场常规管理程序及免疫程序进行管理。

1.3 样品采集

1.3.1 母猪血液采集

分别在母猪妊娠第60 天、分娩当天、仔猪断奶当天，于早晨饲喂前，从耳缘静脉采血4～5 mL到离心管中，静置10 min 后离心，将血清分装于1.5 mL EP（Eppendorf）管中，于-20 ℃条件下冷冻，待测。

1.3.2 母猪粪便采集

于试验结束当天07：00—08：00，在每个重复中采集1 头母猪的新鲜粪便，放入无菌封口袋中，置于-80 ℃冰箱中保存，待测。

1.4 指标测定

1.4.1 母猪繁殖性能

母猪分娩时，记录母猪总产仔数、窝产活健仔数（初生体质量≥0.8 kg），称量仔猪个体体质量，计算健仔初生平均体质量和初生窝体质量。仔猪于25 日龄断奶，记录断奶仔猪数，称量每头断奶仔猪体质量，计算断奶平均体质量和断奶窝体质量。

1.4.2 母猪血清抗氧化性能指标

采用黄嘌呤氧化酶法测定血清总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性，采用比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性，采用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。具体操作参照试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）说明书进行。

1.4.3 母猪血清炎症因子水平

采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测血清炎症因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6, IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）水平。具体操作严格按照试剂盒（购自武汉云克隆科技股份有限公司）说明书进行。

1.4.4 母猪粪便微生物数量

使用粪便基因组DNA提取试剂盒[购自天根生化科技（北京）有限公司]提取粪便微生物总DNA。根据文献报道的引物序列，分别合成真细菌[12]、大肠埃希菌[12]、乳杆菌属[13]、双歧杆菌属[14]、产气荚膜梭菌[15]、拟杆菌属[16]的引物，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法测定粪便微生物数量；以真细菌16S rDNA 为看家基因[12]，采用2-△△CT法计算各微生物相对数量。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient level of basal diets(air-dry basis)

1.5 数据处理及统计分析

用Excel 2013 软件对数据进行预处理，应用SPSS 21.0 统计软件对数据进行单因素方差分析和邓肯多重比较，对显著性指标进行二次曲线回归分析。结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 广东紫珠提取物对母猪繁殖性能的影响

由表2 可见，母猪日粮中添加不同水平广东紫珠提取物对母猪繁殖性能有显著影响。与对照组相比，添加不同水平广东紫珠提取物对窝总产仔数、窝产活仔数及产活仔率均无显著影响（P＞0.05），但使窝总产仔数、窝产活仔数及产活仔率均有不同程度的提高。50和100 mg/kg组仔猪初生体质量及100 和150 mg/kg 组初生窝体质量均显著高于对照组（P＜0.05）。150 mg/kg组仔猪断奶体质量及断奶窝体质量均显著高于对照组（P＜0.05），而其他各组与对照组差异不显著（P＞0.05）。回归分析表明：仔猪初生窝体质量与广东紫珠提取物添加水平呈显著的二次曲线回归关系（P=0.035），回归方程为y=-0.000 3x2+0.072 4x+14.586（R2=0.965 1），方程的常数项、一次项和二次项系数均达显著水平（P＜0.05）；当广东紫珠提取物添加量为121 mg/kg时，仔猪初生窝体质量达到最大。

2.2 广东紫珠提取物对母猪血清抗氧化水平的影响

由表3 可见，母猪日粮中添加广东紫珠提取物显著影响母猪血清SOD 活性和MDA 水平，而对GSH-Px 活性无显著影响（P＞0.05）。在孕中期，添加广东紫珠提取物各组SOD 水平均显著高于对照组（P＜0.05），添加100 mg/kg 及以上水平广东紫珠提取物显著降低血清MDA 水平（P＜0.05）。回归分析表明：孕中期血清SOD 活性与广东紫珠提取物添加水平呈显著二次曲线回归关系（P=0.039），得到方程y=-0.001x2+0.294x+78.786（R2=0.922）；当广东紫珠提取物添加量为161 mg/kg 时，血清SOD 活性达到最高。在分娩当天，200 mg/kg广东紫珠提取物组SOD活性最高，且显著高于对照组（P＜0.05）；添加广东紫珠提取物显著降低血清MDA 水平（P＜0.05）。通过回归分析发现：分娩时母猪血清MDA含量随广东紫珠提取物添加水平升高呈先降后升的二次曲线回归关系（P=0.000 1），回归方程为y=0.000 1x2-0.031x+7.367（R2=0.999 6）；当广东紫珠提取物添加量为126 mg/kg 时，MDA 含量最低。在仔猪断奶当天，与对照组相比，添加广东紫珠提取物显著提高母猪血清SOD 活性（P＜0.05），当添加到100 mg/kg 及以上水平时，血清MDA含量显著降低（P＜0.05）。

表2 广东紫珠提取物对母猪繁殖性能的影响Table 2 Effects of C.kwangtungensis extract on reproductive performance of sows

表3 广东紫珠提取物对母猪血清抗氧化水平的影响Table 3 Effect of C.kwangtungensis extract on serum antioxidant capacity of sows

2.3 广东紫珠提取物对母猪促炎因子的影响

由表4 可见，广东紫珠提取物对母猪产后炎症具有一定的缓解作用。在孕中期，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平随着广东紫珠提取物添加量的升高而降低，其中：200 mg/kg组IL-1β水平与对照组相比差异达显著水平（P＜0.05），150 和200 mg/kg 组IL-6水平均显著低于对照组（P＜0.05），广东紫珠提取物各组TNF-α水平均显著低于对照组（P＜0.05）。分娩当天，广东紫珠提取物各组IL-1β、IL-6 及TNF-α水平均显著低于对照组（P＜0.05），且IL-1β和TNF-α水平随广东紫珠提取物添加量的升高呈显著的二次曲线变化，其中：IL-1β的回归方程为y=0.000 2x2-0.071 7x+12.675（R2=0.970 2，P=0.030），TNF-α的回归方程为y=0.002 3x2-0.771x+157.08（R2=0.992，P=0.008）。由此推算，当广东紫珠提取物 添 加 量 分 别 为164 和165 mg/kg 时，IL-1β和TNF-α水平分别达到最低。在断奶当天，150 和200 mg/kg 组IL-1β和IL-6 水平均显著低于对照组（P＜0.05），而广东紫珠提取物各组TNF-α水平均显著低于对照组（P＜0.05）。

表4 广东紫珠提取物对母猪促炎因子的影响Table 4 Effect of C.kwangtungensis extract on inflammatory factors of sows pg/mL

2.4 广东紫珠提取物对母猪肠道菌群的影响

由图1 可见，母猪日粮中添加不同水平广东紫珠提取物对肠道微生物菌群有显著影响。与对照组相比，添加50 mg/kg及以上的广东紫珠提取物显著增加了乳杆菌属和双歧杆菌属细菌数量（P＜0.05）；添加100 mg/kg 及以上的广东紫珠提取物显著降低了大肠埃希菌和产气荚膜梭菌数量（P＜0.05）；添加150 和200 mg/kg 的广东紫珠提取物可显著增加拟杆菌属细菌数量（P＜0.05）。

3 讨论

随着现代养殖业的集约化、规模化发展，母猪长期处于高负荷生产状况下，极易出现免疫力和生产性能下降、繁殖障碍性疾病等问题，限制了养猪业的快速发展。为突破这一瓶颈，大量的抗生素和化学合成药物被应用于母猪的保健、疾病预防与治疗、母猪的繁殖性能提高等方面[17]，但随之而来的动物免疫力下降、耐药性及药物残留等负面效应严重威胁着畜禽产品安全和人类健康。植物提取物因富含多种生物活性成分且具备天然、绿色、无耐药性及药物残留等特点，成为最具前景的抗生素替代物之一[18]。研究证明，植物提取物在提高母猪生产性能、免疫功能、抗氧化性能及维持肠道微生物稳态方面有显著作用[19]。

3.1 广东紫珠提取物对改善母猪繁殖性能的作用

母猪总产仔数、活仔率及活仔的初生体质量、初生窝体质量、断奶体质量和断奶窝体质量等是衡量母猪繁殖性能的重要指标，也是保证仔猪断奶后保持较高生产性能的前提条件[20-21]。植物提取物含有较多生物活性物质，可通过不同的作用途径影响母猪生产性能。杜莉等[22]报道，在母猪饲粮中添加40 mg/kg 博落回提取物，可显著提高仔猪初生平均体质量和初生窝体质量。曾丹等[23]研究发现，在母猪饲粮中添加0.1%党参提取物，可显著提高仔猪初生体质量。本实验中，在母猪妊娠期和泌乳期添加广东紫珠提取物可提高仔猪的初生体质量、初生窝体质量、断奶体质量和断奶窝体质量。由于各组间仔猪数量不具有显著差异，因此初生窝体质量和断奶窝体质量的增加主要是仔猪个体体质量显著增加的结果，说明在母猪饲料中添加广东紫珠提取物可以在一定程度上提高母猪繁殖性能和仔猪生长性能。这可能是由于广东紫珠提取物中的苯乙醇苷类和黄酮类等活性成分发挥抑菌抗炎和抗氧化作用，通过改善母猪免疫功能和抗氧化功能及肠道菌群平衡等综合效果来提高母猪健康状况，从而促进了仔猪胚胎期和出生后的发育。

图1 广东紫珠提取物对母猪肠道菌群的影响Fig.1 Effect of C.kwangtungensis extract on intestinal flora of sows

3.2 广东紫珠提取物对提高母猪抗氧化能力的作用

母猪在妊娠、分娩和泌乳阶段，其生理状态和体内代谢会发生一系列变化，这将会导致内源性自由基大量增加[24]，抗氧化和免疫功能大幅下降，进而影响母猪的生产性能和哺乳仔猪的健康水平。SOD 和GSH-Px 活性的高低间接反映了机体清除自由基能力的强弱，MDA 可间接反映组织脂质过氧化物损伤程度[25]。本试验中，广东紫珠提取物可以显著提高母猪妊娠、分娩和哺乳阶段SOD 活性，显著降低各阶段MDA含量。这提示广东紫珠提取物具有较强的抗氧化活性，可提高繁殖母猪机体清除自由基能力，并有效缓解繁殖母猪的氧化应激。这是由于广东紫珠提取物中富含的苯乙醇苷类、黄酮类和酚类物质具有显著的抗氧化活性。CAI 等[6]通过采用清除1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、2，2-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS＋·）、超氧阴离子，以及Cu2＋螯合法、抗脂质过氧化反应等研究发现，广东紫珠提取物具有较强的抗氧化活性，其含有的抗氧化物质至少由9种苯乙醇苷类如连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷等和1 种黄酮类（鼠李秦素）物质组成；连翘酯苷苯环上的酚羟基邻位的羟基有很强的抗氧化和自由基清除能力，可以有效保护细胞和机体免受自由基诱导的损伤[26]。

3.3 广东紫珠提取物对缓解母猪产后炎症的作用

母猪在分娩和泌乳时易产生组织损伤，使病原微生物乘虚而入，从而出现生殖系统炎症和乳腺炎；炎症发生时巨噬细胞和外周单核细胞产生的细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等增加，从而诱导发热，触发细胞凋亡，引起氧化应激损伤[27]。这些损伤轻则导致母猪发热，泌乳减少，延误下次配种妊娠，重则使其丧失繁殖能力。体外试验表明，当广东紫珠提取物质量浓度＞40 μg/mL时，可抑制脂多糖诱导的巨噬细胞TNF-α和IL-8的分泌[7]，说明广东紫珠提取物具有较强的抗炎效果。本试验结果支持了前人的研究结论，广东紫珠提取物可以有效降低母猪妊娠、分娩和哺乳阶段血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。可见，广东紫珠提取物对繁殖母猪抗炎有很好的效果。洪燕龙[28]研究发现，总黄酮对二甲苯涂搽小鼠耳郭造成的急性炎症模型可显著抑制致炎后小鼠耳郭的肿胀率，总黄酮对小鼠皮下植入棉球造成肉芽肿增生的慢性炎症具有明显的抑制作用；因此认为，广东紫珠总黄酮为广东紫珠抗炎的有效成分。

3.4 广东紫珠提取物对优化母猪肠道菌群结构的作用

妊娠母体肠道菌群重塑是诱导妊娠代谢紊乱综合征的重要角色，且妊娠过程中发生的氧化应激会进一步导致母体肠道菌群紊乱。优化母猪肠道微生物结构、保持肠道微生态平衡对维护母猪健康状况及提高繁殖性能具有重要意义。植物提取物如黄芪多糖、牛至油和皂苷等具有促进乳杆菌属细菌等有益菌生长、抑制大肠埃希菌等有害菌增殖及维持机体肠道微生物稳态的作用[19]。体外试验结果表明，广东紫珠提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和伤寒沙门菌等有较强的抑制作用[7,29]，但是其体内调节肠道微生物的效果未见报道。本研究表明，母猪日粮中添加150 mg/kg 及以上广东紫珠提取物可抑制母猪肠道有害菌大肠埃希菌和产气荚膜梭菌增殖，促进乳杆菌属、双歧杆菌属和拟杆菌属细菌等有益菌的增殖，与其他植物提取物的效果基本一致。这可能是由于广东紫珠提取物中连翘酯苷发挥了抑菌作用，且具有剂量依赖效应。有研究报道，连翘的核心成分连翘酯苷可抑制大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等有害菌活性，并具有剂量依赖效应[30-31]。由本研究可知，广东紫珠提取物质量分数达150 mg/kg 及以上，对革兰氏阳性和阴性有害菌均有抑制作用，提高了有益菌的竞争性增殖，从而优化母猪肠道菌群结构，促进肠道健康。由于从广东紫珠提取物中纯化单一组分仍比较困难，因此，对其具体抑菌机制仍待进一步研究。

4 结论

本研究表明，在妊娠和泌乳母猪饲粮中添加不同水平的广东紫珠提取物可以改善母猪繁殖性能，提高母猪抗氧能力，缓解产后炎症，优化母猪肠道菌群结构。监测指标不同，所得出的广东紫珠提取物适宜添加量也不同。综合生产性能、抗氧化及免疫性能等各项指标，推荐母猪饲粮中广东紫珠提取物适宜添加量为121～165 mg/kg。