NIX在机械牵张诱导的急性肺损伤中的表达及其严重程度的相关性

赖志远 刘振玉 李修江 周强平

胸部创伤作为目前较为常见的急症之一，它是直接或间接引起急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的最重要因素，且已经成为创伤患者早期死亡的主要原因，已超过创伤患者早期死亡病例的50%[1]。肺作为胸部创伤中最常累计的部位，若早期的肺组织创伤得不到有效的处理，将进一步诱发急性肺损伤[2]，而有大约3.6%的胸部外伤患者将发展成急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[3]；严重的肺组织损伤后，将使得肺通气及氧弥散功能障碍，肺顺应性急剧下降，肺泡萎缩，通气比例失调等一系列病理改变，导致ARDS的发生；甚至继续恶化，最终发生多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，最终威胁生命安全[4-5]。ALI的发病机制较为复杂，就目前所知，肺组织损伤后引起的一系列以血管通透性改变为主要表现的全身炎症级联反应及肺组织缺血缺氧后肺泡上皮细胞的凋亡都在急性肺损伤的发展过程中发挥着重要的作用[6-8]。Nix作为一种促凋亡蛋白，研究发现Nix蛋白在肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ细胞)的凋亡途径中发挥了重要作用[9]。本研究以大鼠撞击伤模型及肺泡上皮细胞为研究对象，通过统计不同肺组织中Nix RNA及Nix蛋白的表达情况，探讨Nix在机械牵张诱导的急性肺损伤中的表达及其严重程度的相关性，并为进一步探明Nix在胸部撞击伤后诱导急性肺损伤的作用机制提供理论基础。

材料与方法

一、实验材料

选取8～10周龄雄性SD大鼠若干只，体重(250±20)g，购自南昌大学动物实验室，在室温25 ℃、45%湿度、12 h自然光照的标准条件下自然喂养。实验开始前禁食8 h，正常饮水，保持周围环境安静无任何干扰。参考相关文献[10-11]，利用BIM-Ⅱ型多功能小生物撞击机对大鼠进行精准胸部撞击后处死大鼠以建立不同程度的大鼠胸部撞击模型，再结合AIS分级法将大鼠撞击模型分为轻伤、重伤、严重伤三个不同肺伤情组，每组按损伤标准各纳入10只大鼠，另选取10只不予处理作为实验对照组。

山羊血清(美国Gibco公司)，PBS缓冲液(美国Gibco公司)山羊兔抗(上海斯信公司)，兔抗人单抗(上海斯信公司)，HRP标记的山羊抗兔二抗(上海斯信公司)，Fast-Plus EvaGreen荧光定量PCR试剂盒(美国ABI公司)，SDS-PVDE凝胶电泳试剂盒(上海斯信公司)，ECL发光试剂盒(上海斯信公司)，其他常规国产分子生物学实验耗材等；BIM-Ⅱ型多功能小生物撞击机(参考陆军军医大学野战外科研究所)，PCR仪(美国ABI公司)，显微成像系统(日本OLYMPUS公司)，凝胶图像分析系统(美国BIOTOP公司)，超高速低温离心机(上海安亭公司)，其他国产常规仪器等主要设备

二、观察指标

1.免疫组化观察：大鼠处死后取肺组织，先用生理盐水冲洗，再用4%多聚甲醛灌注固定24 h，置于不同浓度的酒精中再脱水；取肺组织进行石蜡包埋并制成5um厚等组织切片置于载玻片上。再用二甲苯化蜡，之后将石蜡切片置于梯度乙醇中脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液高压修复修复抗原5 min。0.3% H2O2室浸泡15 min，PBS冲洗5 min 2次，后用5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育20 min，倾去血清。滴加生物素标记的Nix抗体，4 ℃孵育过夜，并于PBS代替NIX抗体处理切片作为隐形对照组。PBS冲洗后滴加生物素标记的TNF-α抗体，37 ℃水浴箱孵育20 min。再次PBS冲洗5 min 3次，DAB显色10 min，之后苏木素复染并脱水后用中性树脂封片。在光镜下观察镜片上棕色区域的分布，用image-pro plus6.0软件分析各组织中棕色区域的IOD值。

2.肺组织病理学观察：刚致死大鼠肺组织，先用生理盐水冲洗，再灌注4%多聚甲醛固定24 h，石蜡连续切片，厚度约为5 μm然后用二甲苯化蜡，再经由高浓度到低浓度的乙醇水合后进行苏木精-伊红(HE)染色5min，再脱水后用中性树脂封片。电镜下观察不同时间肺组织病理学变化。

3.RT-PCR 检测Nix在mRNA水平表达：肺组织离体模型建立参考相关文献[11]。严格按照试剂盒说明书进行不同时间点各模型组待检测细胞总RNA的提取；Nix引物序列：上游：5′-ATG TCT CAC TTA GTC GAG CCG-3′,下游：5′-CTC ATG CTG TGC ATC CAG GA-3′；再根据逆转录试剂盒说明书立即进行RNA的逆转录，以β-actin为内参，反应条件：第一阶段反转录：42 ℃ 15 min，85 ℃ 10 s；第二阶段PCR：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。

4.Western Blot 检测NIX在蛋白水平表达：取不同肺部损伤程度的AT-Ⅱ细胞培养株，倒掉培养液，加入4 ℃预冷的PBS洗涤细胞株3次，吸尽PBS后将培养瓶置于冰上。向各细胞株中加入含1%苯甲基磺酰氟的裂解液，在冰上裂解30 min，于4 ℃超高速低温离心机上以1 200 r/min离心20 min，将离心后的上清液转移至离心管中于-80 ℃保存备用。BCA法测定上清液中BNIP3蛋白浓度，SDS-PVDE凝胶电泳分离目的蛋白并用湿转法将蛋白转至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭液孵育2 h。4 ℃过夜孵育兔抗NIX一抗，之后用TBST洗3次，每次10 min，将PVDF膜在兔抗一抗中室温孵育1 h，用同样方法将HRP标记的山羊抗兔二抗与PVDF膜接触。用ECL发光液显影并曝光，以β-actin作为内参，使用其曝光的灰度值来表示Nix蛋白的相对表达值。

三、统计学方法

结 果

一、大鼠肺组织病理学结果

模型大鼠胸部撞击伤0.5、2、12、24、48、72 h后各组大鼠肺组织内血管及肺泡壁毛细血管均出现扩张充血，双肺出现不同程度的增大、肺水肿，肺泡腔及肺泡间隔之间可见大量液体及红细胞渗出，并可见大量的炎性细胞浸润。以撞击伤后48 h这一变化较为明显，见图1。

图1 撞击伤后48 h大鼠肺组织病理学变化情况

二、肺组织中Nix mRNA及Nix蛋白的表达情况

与对照组相比，在撞击0.5、2、12、24、48、72 h后，各模型组大鼠肺组织中Nix mRNA都存在较为明显增高，Nix mRNA在伤后0.5 h开始增高，并在撞击48 h后Nix的表达达到峰值，撞击伤后72 h已有显著下降(P<0.05)。同样的，与对照组相比，各时间点各模型组大鼠肺组织中Nix蛋白表达同样在伤后0.5 h开始增高，48 h达到峰值，72 h显著下降(P<0.05)。见图2，表1、2。

图2 免疫组化、Western Blot和RT-PCR检测；注：A：免疫组化法检测Nix在致伤组肺组织中的表达(SP法，DAB显色，×400)；B：RT-PCR检测Nix mRNA表达情况；C：Western Blot检测Nix蛋白的表达情况

表1 Nix mRNA表达情况与肺组织损伤程度的关系

三、肺组织中Nix的表达情况和肺组织损伤程度的相关性结果

由表1、表2可知，在0～48 h这段时间内，随着撞击伤严重程度的提升，Nix mRNA表达水平也呈相应的增高(P<0.05)。同样的，大鼠肺组织Nix蛋白表达水平也随撞击伤严重程度的增高而增高(P<0.05)。由此可得出结论，在一定时间内，Nix的表达情况与肺损伤程度成正相关关系。

表2 Nix蛋白表达情况与肺组织损伤程度的关系

讨 论

胸部撞击伤作为临床常见的一种疾病类型，是创伤所致死亡的第二大病因，伤者主要表现为不同程度的呼吸衰竭、血流动力学不稳定、肺部出血水肿，部分患者可能在伤后24～48 h引发ARDS，而呼吸窘迫综合征则可进一步加重患者病情，增加其死亡风险[12-13]。肺作为胸部最大的脏器，胸部撞击伤后肺损伤首当其冲，它不仅能引起肺泡细胞的急性死亡，也能引起肺泡细胞的迟发性死亡[10]。Nix作为细胞凋亡基因的一员，我们通过前期研究发现，Nix在肺组织的继发性损伤中也扮演着重要的角色。由于撞击伤后Nix基因的表达情况与肺损伤的损伤程度的相关性研究并无明确定论[14]，因此，我们想通过此次分析就NIX在机械牵张诱导的急性肺损伤中的表达及其严重程度的相关性进行进一步的探讨，以期对急性肺损伤达成更加深入的认识，并为其预防及治疗提供更多的途径。

胸部撞击伤后肺组织暴露在缺血缺氧及失控性的炎症反应等一系列不利条件下，极易发生肺组织的结构及功能的改变，而后发生的AT-Ⅱ细胞的凋亡在急性肺损伤的发生发展中发挥着重要的作用[9，15-16]。细胞凋亡是指由基因调控的细胞的程序性死亡过程，我们机体通过细胞凋亡的途径来维持自身的平衡，其中许多的基因及其产物都有序参与其中。细胞发生凋亡的机制被认为是Bcl-2家族在线粒体凋亡通路中发挥了重要的作用，而Nix蛋白作为Bcl-2家族的一个促凋亡蛋白,也可通过诱导线粒体自噬，在低氧环境下诱导细胞凋亡[17]。细胞凋亡的途径可分为内源行凋亡途径和外源性凋亡途径，其中外源性凋亡途径又称为死亡受体途径，是由细胞外的肿瘤坏死因子等引发的；内源性凋亡途径又称为线粒体/细胞色素C介导的通路，而在内源性凋亡途径中主要又是通过Caspase依赖性凋亡通路发挥关键作用[18]，除了Caspase依赖性凋亡通路外，Bratton等还发现了另外一种非Caspase依赖性凋亡通路同样在细胞凋亡中至关重要[19-20]。其中Nix基因正是通过非Caspase依赖性凋亡通路参与细胞凋亡的过程并在其中发挥了至关重要的作用[21-22]。

Nix也称为与Bcl-2/E1B-19K相互作用的蛋白3-like(BNIP3L蛋白)，属于Bcl-2家族成员，含有Bcl-2家族相似的区域，因此也被认为是一种促凋亡蛋白[23-24]；他的作用机制尚未十分明确，目前认为它既可以通过自身结构的改变诱导细胞凋亡，也可以通过与多种细胞因子等结合诱导细胞凋亡[25]。McLelland等[26]在帕金森病的相关研究中发现了线粒体通过形成线粒体来源的囊泡，靶向溶酶体进行降解，最终发生Nix相关的线粒体自噬过程，这也为我们进一步的研究提供了可能。通过不断的深入研究，已经有越来越多的证据证实了Nix相关线粒体自噬在细胞凋亡中的作用[27-29]。更重要的是，Rajasekaran等[30-32]发现肺组织损伤后肺组织中的Nix表达明显升高，这提示了Nix可能与肺组织的凋亡存在一定关系。但是，关于Nix与肺组织损伤程度的相关研究报道较少。

本文通过机械牵张建立急性肺损伤大鼠模型发现，与对照组相比，在撞击伤0.5、2、12、24、48、72 h后，各模型组大鼠肺组织中Nix mRNA及Nix蛋白都有不同程度的升高，提示Nix表达水平在急性肺损伤后显著升高。且在48 h内，肺组织损伤越重，Nix表达水平越高；肺损伤48 h后，Nix表达水平逐渐下降，并将在一定时间后回归正常水平。Diwan等[33]研究发现，组织缺氧后，Nix的表达可以通过影响线粒体的功能，进而影响细胞的凋亡过程，造成肺组织损伤。而肺组织细胞的凋亡坏死又将影响肺换气功能，加之创伤后机体启动应激系统，触发多种炎性介质、活性氧簇(ROS)等有害物质的过多聚集，进一步加重肺组织损伤[34]。

对于胸部撞击伤后引起的急性肺损伤，如若早期不能得到有效的干预，进而将发展为急性呼吸衰竭，更严重的将导致ARDS或MODS，将极大影响患者的生存时长及生活质量。通过此次研究，我们知道了胸部撞击伤后肺组织Nix的表达水平会显著升高，并且与肺损伤程度呈一定的正相关，而这一过程主要发生在创伤后48 h之内，这为我们对创伤后急性肺损伤的早期病情评估及相关预后判定提供了新的思路方法，以便我们对疾病进行早期干预，提高临床疗效。